miR-140在結(jié)腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、轉(zhuǎn)移是引起惡性腫瘤死亡的主要生物學(xué)特性和原因。腫瘤轉(zhuǎn)移的步驟包含相應(yīng)的順序以及相關(guān)聯(lián)的步驟過程，其中很多步驟受到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。腫瘤細(xì)胞獲得間充質(zhì)特性的能力，可以增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力、誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性,并抑制細(xì)胞凋亡和程序性衰老,使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的過程已經(jīng)被報道在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用包括結(jié)腸癌(CRC)。
　　結(jié)腸癌(CRC)是發(fā)生在結(jié)腸部位的消化道腫瘤，為我國最常見的惡性腫瘤

2、之一，近年來發(fā)病率不斷增高，嚴(yán)重危害了人們的身體健康。在美國，因癌癥死亡的惡心腫瘤中結(jié)腸癌(CRC)位居第三位，據(jù)報告每年大約造成50000人左右死亡。雖然手術(shù)結(jié)合輔助治療提高了結(jié)腸癌(CRC)的預(yù)后生存率,但是仍有大約一半的患者發(fā)生了轉(zhuǎn)移。抑制結(jié)腸癌(CRC)的轉(zhuǎn)移是改善結(jié)腸癌(CRC)的發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后的有效治療策略。
　　微小RNA（miRNAs）是一類通過與靶基因的3′非編碼區(qū)（UTR）相結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因蛋白

3、表達(dá)水平的非編碼單鏈小核糖核酸（RNA）分子。一些研究表明miRNAs可以作為調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要抑制劑或啟動子。SMAD蛋白家庭成員3(Smad3)作為TGF-β信號通路的下游的一個關(guān)鍵因素,同時也是惡性腫瘤如結(jié)腸癌(CRC)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的一個至關(guān)重要的誘導(dǎo)物。TGF-β結(jié)合兩個跨膜受體,I型(TGFBRI)和II型(TGFBRII),導(dǎo)致Smad2（p-sSmad2）和Smad3(p-Smad3)磷酸化,同

4、時活化物在細(xì)胞核內(nèi)與 Smad4相結(jié)合,結(jié)合物可以調(diào)節(jié)下游上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因的表達(dá)。有研究確認(rèn)，Smad3是microRNA-140-5p(miR-140)的直接靶點(diǎn)。
　　miR-140首次明確發(fā)現(xiàn)是于斑馬魚和小鼠胚胎的軟骨發(fā)育包括長和扁骨發(fā)生發(fā)展中，miR-140可以抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞(CSC)的生存和轉(zhuǎn)移可能通過抑制Smad2和自噬來完成的。下調(diào)miR-140誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移

5、可能是通過調(diào)控靶基因Slug來完成的。miR-140在影響結(jié)腸癌（CRC）侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　第一部分 miR-140靶向調(diào)控Smad3基因的表達(dá)研究
　　目的：驗(yàn)證Smad3確為miR-140的靶點(diǎn)。
　　方法：在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和RKO中通過瞬時轉(zhuǎn)染，使miR-140上調(diào)或者下調(diào)，并且同時轉(zhuǎn)染沉默Smad3的模擬物（siRNA），通過qRT-PCR測量轉(zhuǎn)染后，miR-140的表達(dá)高低變化，

6、以及Smad3 mRNA。應(yīng)用免疫印跡的方法檢測Smad3和p-Smad3蛋白變化，來驗(yàn)證轉(zhuǎn)染率，以及小RNA miR-140與基因Smad3之間的關(guān)系。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測miR140對細(xì)胞增殖的影響。通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)來檢測miR-140對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO細(xì)胞克隆形成能力的影響；
　　結(jié)果：通過熒光qRT-PCR檢測，轉(zhuǎn)染miR-140的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO中與對照組相比，miR140組中的miR-140

7、表達(dá)增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對照組相比，上調(diào)miR-140后 Smad3 mRNA含量無增減變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比miR-140組Smad3和 p-Smad3的蛋白含量降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）,并且抑制了腫瘤細(xì)胞的生長和細(xì)胞克隆形成的能力(P<0.01)。而在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO中轉(zhuǎn)染,使miR-140低表達(dá)能使細(xì)胞中Smad3和p-Smad3蛋白表

8、達(dá)增高（P<0.01），并且促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長和細(xì)胞的克隆形成能力；而miR-140抑制劑和Smad3 siRNA共轉(zhuǎn)染對Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)和腫瘤生長、細(xì)胞的克隆形成能力無明顯影響（P>0.05）
　　結(jié)論：上調(diào)miR-140可使Smad3和p-Smad3表達(dá)降低，但不影響Smad3 mRNA的表達(dá)，并且抑制了腫瘤細(xì)胞的生長：相反使 miR-140的表達(dá)降低，可升高 Smad3和 p-Smad3的含量，并且促進(jìn)腫

9、瘤生長。miR-140能夠靶向調(diào)控基因Smad3的表達(dá)來影響腫瘤生長、細(xì)胞的克隆形成能力。
　　第二部分 miR-140調(diào)控EMT的作用機(jī)制研究
　　目的：通過體外實(shí)驗(yàn)探討miR-140調(diào)控EMT對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO遷移和侵襲能力的影響。
　　方法：在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和RKO中通過瞬時轉(zhuǎn)染，使miR-140上調(diào)或者下調(diào)，并且同時轉(zhuǎn)染沉默Smad3的模擬物（siRNA），通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwel

10、l遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，研究高表達(dá)或低表達(dá)miR-140對結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和RKO遷移和侵襲能力的作用方式。免疫印跡和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法研究EMT相關(guān)蛋白E-cadherin及Vimentin的含量變化。探討miR-140在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用及其調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果：劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比miR-140組細(xì)胞的遷移能力減弱，細(xì)胞的遷移距離具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，

11、與Con和NC等對照組相比，miR-140組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。EMT相關(guān)分子 E-cadherin表達(dá)增高，而 Vimentin表達(dá)減少（P<0.01）。siSmad3組與miR-140組的作用相比，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與Con和NC等對照組相比使miR-140表達(dá)降低，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），EMT相關(guān)分子E-cadherin表達(dá)減少，而V

12、imentin表達(dá)增高（P<0.01）。而miR-140抑制劑和Smad3 siRNA共轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的遷移和侵襲能力無明顯變化（P>0.05）。
　　結(jié)論：miR-140的過表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO的遷移和侵襲能力，阻滯了EMT的發(fā)生；miR-140的表達(dá)降低則促進(jìn)EMT的發(fā)生，增高結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO的遷移和侵襲能力。同時使miR-140表達(dá)降低和沉默Smad3，則對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO遷移和侵襲

13、的能力和EMT的發(fā)生無明顯影響。
　　第三部分 miR-140對結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞裸鼠移植瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用
　　目的：探討過表達(dá)miR-140抑制裸鼠移植瘤的機(jī)制
　　方法：將裸鼠通過背部或尾靜脈注射的方法，各組分別注射慢病毒感染的miR-140細(xì)胞、陰性對照細(xì)胞、和沉默Smad3的細(xì)胞，并采用免疫組織化學(xué)染色和western blotting技術(shù)分析相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：過表達(dá)miR-14