MMP-9在食管鱗癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　食管癌(esophageal cancer, EC)是人類十大惡性腫瘤之一，中國是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，其中以食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)為主。隨著社會經(jīng)濟地位，生活方式和醫(yī)療水平的改善，我國食管癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年下降的趨勢，但患者的5年生存率仍然很低，目前仍是治療的難點，其主要原因就是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，上皮間

2、質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是多細胞生物胚胎發(fā)生過程的基礎，其在組織重建、傷口修復等過程中都有發(fā)揮重要作用。此外，EMT也是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得侵襲、遷移和抗凋亡能力的重要生物學進程。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs），是一類依賴金屬鈣離子（Ca2+），鋅離子（Zn2+）的內(nèi)肽酶家族，它的主要功能就是幾乎能降解細胞外基

3、質(zhì)的各種蛋白組分。其中，MMP-9又稱為明膠酶B，作為降解細胞外基質(zhì)和基底膜的關鍵酶，對惡性腫瘤的發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及間質(zhì)血管生成起著重要的作用。最近研究表明，MMP除了可以降解細胞外基質(zhì)的各種蛋白組分之外，一些MMP（如MMP-3 MMP-9、MMP-14和MMP-28等）可以誘導EMT或EMT相關進程。
　　轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growthfactor, TGF)-β1是調(diào)節(jié)EMT的關鍵因素之一，它廣泛參與人類

4、各種惡性腫瘤EMT的發(fā)生。更為重要的是，有研究報道， MMP-9參與TGF-β誘導腎小球內(nèi)皮細胞EMT進程。這說明MMPs在TGF-β介導的EMT中起到重要的作用。
　　截至目前，MMP-9是否參與食管鱗癌 EMT進程，MMP-9是否參與 TGF-β1誘導的食管鱗癌EMT進程，這些都尚未見報道。本研究為了解決這些問題，將從以下四個部分進行研究。
　　第一部分：食管鱗癌組織中MMP-9、Snail和TGF-β1的表達與EMT的

5、關系及臨床意義
　　目的：
　　探討MMP-9、Snail和TGF-β1與 E-cadherin的關系及其與臨床病理學因素的關系。
　　方法：
　　1.采用免疫組化 SP法檢測77例食管鱗狀細胞癌組織及癌旁正常組織中MMP-9、Snail、TGF-β1和E-cadherin蛋白的表達情況。
　　2.分析MMP-9與Snail、TGF-β1和E-cadherin的關系及與性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋

6、巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期等臨床病理參數(shù)的關系。
　　結(jié)果：
　　1.食管鱗癌組織較癌旁正常組織表達MMP-9（74.03％vs31.17%）、Snail（68.83%vs25.97%）、TGF-β1（71.43%vs36.36%）明顯增高（P<0.01），E-cadherin（44.16%vs100.0%）明顯下降（P<0.01）。
　　2. MMP-9蛋白表達與腫瘤組織學分級（I vs II vs III：58.33

7、%vs77.27%vs100.0%，P＜0.05）、腫瘤浸潤深度（T1 vs T2 vs T3：42.86%vs65.0%vs88.37%， P＜0.01）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無vs有：67.21% vs100.0%，P＜0.01）及TNM分期（I vs II vs III：66.67%vs67.39%vs100.0%，P＜0.05）呈正相關，而與性別、年齡無關（P＞0.05）。Snail蛋白表達與腫瘤浸潤深度（T1 vs T2 vs T3：

8、35.71%vs75.00%vs76.74%，P＜0.05）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無vs有：60.66% vs100.0%，P＜0.01）呈正相關，而與性別、年齡、腫瘤組織學分級及TNM分期無關（P＞0.05）。TGF-β1蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無vs有：65.57%vs93.75%）和TNM分期（I vs II vs III：46.67%vs73.91%vs87.50%）呈正相關（P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤組織學分級及腫瘤浸潤深度無

9、關（P＞0.05）。E-cadherin蛋白表達與腫瘤浸潤深度（T1 vs T2 vs T3：71.43%vs55.0%vs30.23%）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無vs有：50.82%vs18.75%）呈負相關（P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤組織學分級、浸潤深度及TNM分期無關（P＞0.05）。
　　3.食管鱗狀細胞癌組織中，MMP-9與 Snail蛋白呈正相關（γs＝0.292，P＜0.01）。MMP-9與 E-cadherin蛋白

10、呈負相關（γs＝–0.295，P＜0.01）；Snail與E-cadherin蛋白呈負相關（γs＝–0.241，P＜0.01）。MMP-9與TGF-β1蛋白呈正相關（γs＝0.327，P＜0.01）；TGF-β1與E-cadherin蛋白呈負相關（γs＝–0.432， P＜0.01）。
　　第二部分：MMP-9在食管鱗癌EMT中的作用及對其侵襲遷移的影響
　　目的：
　　探討MMP-9對食管鱗癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲遷

11、移能力的影響及可能的機制。
　　方法：
　　1. MMP-9表達上調(diào)對食管鱗癌EMT及侵襲遷移能力的影響：外源性重組人MMP-9（rMMP-9）蛋白刺激食管鱗癌EC-1細胞株不同時間(0h，24 h，48 h)，于倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變；Real-time PCR，Western blot及細胞免疫熒光方法檢測E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白的表達變化；采用侵襲實驗及劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移能力的

12、變化。
　　2. MMP-9表達下調(diào)對食管鱗癌EMT及侵襲遷移能力的影響：MMP-9 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC-1細胞株48h，于倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變；Real-time PCR，Western blot及細胞免疫熒光方法檢測E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白的表達變化；采用侵襲實驗及劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移能力的變化。
　　3.通過Real-time PCR和Western blot方法檢

13、測MMP-9表達上調(diào)/下調(diào)后對食管鱗癌EC-1細胞中Snail表達的影響。
　　4.利用siRNA技術干擾Snail的表達，然后用rMMP-9刺激EC-1細胞48h后，通過Real-time PCR和Western blot方法檢測EC-1細胞EMT分子標記物E-cadherin和Vimentin的表達變化；采用侵襲實驗及劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1. MMP-9表達上調(diào)對食管鱗癌EMT及侵

14、襲遷移能力的影響：外源性rMMP-9刺激食管鱗癌EC-1細胞株后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由上皮細胞形態(tài)向間質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，以48h最為顯著。Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，與空白組（0h）相比，rMMP-9刺激后E-cadherin mRNA[24h組(0.62±0.07vs1.00±0.00)、48h組(0.48±0.09 vs1.00±0.00)，均P<0.01]及蛋白[24h組(0.51±0.0.07

15、 vs0.67±0.05)，P<0.05、48h組(0.43±0.09 vs0.67±0.05)，P<0.01]的表達明顯降低， Vimentin mRNA[24h組(1.30±0.08vs1.00±0.00)、48h組(1.58±0.09vs1.00±0.00)，均P<0.01]及蛋白[24h組(0.66±0.07 vs0.50±0.07)，P<0.05、48h組(0.77±0.06 vs0.50±0.07)，P<0.01]的表達明顯

16、上調(diào)。細胞免疫熒光結(jié)果和Western blot結(jié)果相一致。此外，細胞侵襲實驗和劃痕實驗結(jié)果顯示：與空白組（0h）相比，rMMP-9刺激組細胞的穿膜細胞數(shù)（113±12 vs75±9）顯著增多及劃痕愈合能力（0.66±0.05 vs0.43±0.07）顯著增強（P＜0.05）。
　　2. MMP-9表達下調(diào)對食管鱗癌EMT及侵襲遷移能力的影響：MMP-9 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC-1細胞株后，與空白組和陰性對照組（轉(zhuǎn)染無義序

17、列）相比，MMP-9 shRNA組中部分細胞形態(tài)由長梭形或間質(zhì)樣形態(tài)向上皮細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，細胞粘附性增強，細胞與細胞間的連接變的緊密；Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白組相比，MMP-9 shRNA組中MMP-9 mRNA（0.36±0.05 vs0.92±0.07 vs1.00±0.00）及蛋白（0.48±0.05 vs0.64±0.06 vs0.72±0.08）的表達明顯下調(diào)（P＜0.01

18、），E-cadherin mRNA（1.75±0.09vs0.90±0.07 vs1.00±0.00）及蛋白（0.80±0.06 vs0.57±0.05 vs0.62±0.08）的表達明顯上調(diào)（P＜0.01），Vimentin mRNA（0.70±0.08vs0.91±0.05vs1.00±0.00）及蛋白（0.48±0.03 vs0.63±0.04 vs0.68±0.07）的表達明顯下調(diào)（P＜0.05）。細胞免疫熒光結(jié)果和Wester

19、n blot結(jié)果相一致。此外，細胞侵襲實驗和劃痕實驗結(jié)果顯示：與陰性對照組和空白組相比，MMP-9 shRNA組細胞穿膜細胞數(shù)（49±5vs78±4vs82±8）顯著降低及劃痕愈合能力（0.25±0.07 vs0.43±0.08 vs0.44±0.05）顯著減弱（P＜0.05）。
　　3. MMP-9對食管鱗癌細胞中調(diào)節(jié)EMT的關鍵分子Snail的影響：Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，當MMP-9表達

20、上調(diào)時，與空白組（0h）相比， SnailmRNA[24h組(1.55±0.08vs1.00±0.00)、48h組(2.29±0.11vs1.00±0.00)，均P<0.01]及蛋白[24h組(0.69±0.04 vs0.56±0.08)，P<0.05、48h組(0.80±0.07 vs0.56±0.08)，P<0.01]的表達顯著增加；當MMP-9表達下調(diào)時，與陰性對照組及空白組相比，MMP-9 shRNA組中Snail mRNA（0

21、.65±0.08vs0.90±0.08vs1.00±0.00）及蛋白（0.54±0.08 vs0.69±0.04 vs0.72±0.06）表達顯著降低（P＜0.01）。
　　4. Snail表達下調(diào)對食管鱗癌EMT及侵襲遷移能力的影響：Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，Snail siRNA組中Snail mRNA（0.43±0.04 vs1.00±0.00）及蛋白（0.31±0.05 v

22、s0.51±0.07）的表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01）， E-cadherin mRNA（1.49±0.07vs1.00±0.00）及蛋白（0.82±0.06vs0.66±0.03）的表達水平顯著上調(diào)（P＜0.01），Vimentin mRNA（0.56±0.08vs1.00±0.00）及蛋白（0.37±0.05 vs0.52±0.06）的表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；穿膜細胞數(shù)（42±8 vs82±4）顯著降低及劃痕愈合能力（0

23、.21±0.09 vs0.41±0.05）顯著減弱（P＜0.05）。
　　5. Snail表達下調(diào)對MMP-9介導的食管鱗癌EMT及侵襲遷移能力的影響：Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，與rMMP-9組相比，SnailsiRNA+rMMP-9組中E-cadherin mRNA（0.72±0.06vs0.44±0.09）及蛋白（0.57±0.04vs0.45±0.05）的表達水平升高（P＜0.01），Vi

24、mentin mRNA（0.73±0.09vs1.36±0.08）及蛋白（0.44±0.05 vs0.80±0.04）的表達水平下降（P＜0.01）；穿膜細胞數(shù)（61±10 vs121±9）降低及劃痕愈合能力（0.34±0.06 vs0.59±0.04）減弱（P＜0.01）。
　　第三部分：MMP-9在TGF-β1誘導食管鱗癌EMT中的作用及對其侵襲遷移的影響
　　目的：
　　探討MMP-9在TGF-β1介導食管鱗癌E

25、MT中的作用及對其侵襲遷移的影響。
　　方法：
　　1.TGF-β1（10ng/ml）處理食管鱗癌EC-1細胞不同時間（0h，24 h，48 h），于倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變；采用Real-time PCR、Western blot及細胞免疫熒光方法檢測E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白的表達變化。
　　2.廣譜MMP抑制劑GM6001處理食管鱗癌EC-1細胞后，于倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變；

26、采用Real-time PCR、Western blot及細胞免疫熒光方法檢測E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白的表達變化。
　　3.采用Real-time PCR，熒光素酶報告實驗，明膠酶譜實驗及Western blot，檢測TGF-β1處理食管鱗癌EC-1細胞后MMP-9 mRNA及蛋白的表達變化。
　　4.利用shRNA干擾MMP-9的表達，然后用TGF-β1刺激細胞48h后，采用Real-time

27、 PCR和Western blot檢測E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白的表達變化，侵襲小室實驗及劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1. TGF-β1誘導食管鱗癌EMT：與空白組（0h）相比，TGF-β1刺激后細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由典型的鵝卵石樣上皮細胞形態(tài)向長梭形或紡錘型間質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，刺激48h時最為顯著。Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，與空白組（

28、0h）相比，TGF-β1刺激后E-cadherin mRNA[24h組(0.65±0.04vs1.00±0.00)、48h組(0.46±0.08 vs1.00±0.00)]及蛋白[24h組(0.51±0.03 vs0.67±0.06)、48h組(0.39±0.06vs0.67±0.06)]的表達明顯降低(P<0.01)，Vimentin mRNA[24h組(1.27±0.12 vs1.00±0.00)、48h組(1.40±0.07 vs

29、1.00±0.00)，均P＜0.01]及蛋白[24h組(0.65±0.07vs0.53±0.06)，P＜0.05、48h組(0.73±0.06vs0.53±0.05)，P＜0.01]的表達明顯增加。細胞免疫熒光結(jié)果和Western blot結(jié)果相一致。
　　2. GM6001抑制TGF-β1誘導食管鱗癌EMT：于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，結(jié)果顯示：與TGF-β1組相比，TGF-β1+GM6001組中部分細胞由原來的長梭形或紡錘形間

30、充質(zhì)細胞形態(tài)向上皮細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，與TGF-β1組相比，TGF-β1+GM6001組中E-cadherin mRNA（0.62±0.04 vs0.44±0.07）及蛋白（0.55±0.03 vs0.44±0.06）的表達水平升高（P＜0.05），而Vimentin mRNA[(1.22±0.03vs1.42±0.07)，P＜0.05]及蛋白[(0.71±0.03vs0.82±0

31、.05)，P＜0.01]的表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義。細胞免疫熒光結(jié)果和Western blot結(jié)果相一致。
　　3. TGF-β1促進MMP-9表達上調(diào)：明膠酶譜實驗結(jié)果顯示：與空白組相比， TGF-β1組細胞MMP-9活性明顯增高，GM6001組細胞MMP-9活性明顯降低；與TGF-β1組相比，TGF-β1+GM6001組中MMP-9活性降低。Real-time PCR結(jié)果顯示，與對照組（0h）相比，TGF-β1處理組中

32、MMP-9 mRNA[24h組(1.25±0.10 vs1.00±0.00)、48h組(1.42±0.07 vs1.00±0.00)]的表達水平升高，且具有時間依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒pGL3-Basic的實驗中，空白組和TGF-β1組中MMP-9熒光素酶活性表達均無顯著性差異（P＞0.05）。在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGL3-MMP-9的實驗中，與空白組相比，TGF-β1組中MMP-9的

33、活性（17.26±3.69 vs36.06±5.27）顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與對照組（0h）相比，TGF-β1處理組中MMP-9蛋白[24h組(0.64±0.08 vs0.52±0.04)，P＜0.05、48h組(0.77±0.08 vs0.52±0.04)，P＜0.01]的表達水平升高，且具有時間依賴性，差異有統(tǒng)計學意義。
　　4. MMP-9表達下調(diào)抑制TGF-β1誘導食

34、管鱗癌細胞EMT及細胞侵襲和遷移能力：Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，MMP-9 shRNA組中MMP-9 mRNA（0.42±0.05vs1.00±0.00）及蛋白（0.31±0.04vs0.57±0.06）的表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01），E-cadherin mRNA（1.53±0.08vs1.00±0.00）及蛋白(0.80±0.05vs0.67±0.06)的表達水平顯著上調(diào)（P＜0

35、.01），Vimentin mRNA（0.57±0.08vs1.00±0.00）及蛋白（0.37±0.05 vs0.53±0.08）的表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；與TGF-β1組相比，MMP-9 shRNA+TGF-β1組中E-cadherin mRNA[(0.71±0.06vs0.46±0.08)，P＜0.01]及蛋白[(0.58±0.05vs0.45±0.06)，P＜0.05]的表達水平升高，Vimentin mRNA(0.7

36、0±0.04vs1.40±0.07)及蛋白(0.42±0.04 vs0.82±0.03)的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。此外，細胞侵襲和劃痕實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，MMP-9 shRNA組中穿膜細胞數(shù)（27±4vs69±5）顯著降低，細胞劃痕愈合能力（0.26±0.07 vs0.46±0.08）顯著減弱，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與TGF-β1組相比，MMP-9 shRNA+TGF-β1組中穿膜細胞數(shù)（5

37、8±6 vs119±7）降低及劃痕愈合能力（0.36±0.04 vs0.64±0.06）減弱（P＜0.01）。
　　第四部分：MMP-9阻斷對裸鼠食管鱗癌移植瘤生長及EMT的影響
　　目的：
　　研究MMP-9 shRNA在體內(nèi)對食管鱗癌EMT的影響。
　　方法：
　　1.建立EC-1食管鱗癌裸鼠移植瘤模型，將MMP-9 shRNA轉(zhuǎn)染組、陰性對照組（轉(zhuǎn)染無義序列）細胞及空白組EC-1細胞分別注入裸鼠右前肢

38、腋背部皮下，觀察移植瘤的形成及生長狀況并繪制生長曲線。
　　2.實驗結(jié)束后，取瘤稱重，測量體積并拍照。
　　3.HE染色觀察食管鱗癌移植瘤組織學形態(tài)；采用Real-time PCR及免疫組織化學方法檢測不同組別移植瘤 MMP-9、Snail、E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立了裸鼠食管鱗癌移植瘤模型。
　　2.實驗結(jié)束時，與陰性對照組和空白組相比，M

39、MP-9 shRNA組中移植瘤體積（mm3）（624.69±136.85 vs1118.19±254.85 vs1280.74±371.78）和重量（g）（0.58±0.13 vs0.94±0.17 vs1.04±0.20）明顯減少(P<0.05)。
　　3.與陰性對照組和空白組相比，MMP-9 shRNA組中MMP-9mRNA（0.48±0.06 vs0.92±0.05 vs1.00±0.00）及蛋白（82±7 vs114±6

40、vs125±9）明顯降低（P＜0.01）。Snail mRNA（0.60±0.10 vs0.96±0.05 vs1.00±0.00，P＜0.05）及蛋白（87±8 vs124±4 vs132±10， P＜0.01）明顯降低。E-cadherin mRNA(1.48±0.08 vs0.94±0.08 vs1.00±0.00，P＜0.01)及蛋白（134±12 vs91±32 vs87±12，P＜0.05）表達明顯上調(diào)，Vimentin m

41、RNA（0.70±0.06 vs0.95±0.03 vs1.00±0.00，P＜0.01）及蛋白（68±6 vs102±44 vs122±8，P＜0.05）明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.MMP-9在食管鱗癌組織中的高表達狀態(tài)與Snail、TGF-β1呈正相關性，與E-cadherin呈負相關性，提示三者在促進食管鱗癌EMT中具有協(xié)同作用。
　　2.MMP-9參與食管鱗癌的EMT，且可通過EMT途徑促進食管鱗癌侵襲和遷