碘在體外培養(yǎng)成纖維細胞模型中的作用研究.pdf

1、[目的] 本實驗利用體外培養(yǎng)成纖維細胞模型，運用形態(tài)學觀察、免疫細胞化學技術(shù)、流式細胞術(shù)及相關(guān)生化指標檢測等多種方法研究不同濃度的碘離子及碘分子對體外培養(yǎng)成纖維細胞增殖活性與功能的影響，探討碘對甲狀腺外組織的作用，豐富微量元素碘的實驗研究。 [方法] 1．細胞株：人皮膚成纖維(HSF)細胞株，購于協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學細胞中心。常規(guī)細胞培養(yǎng)，待傳代穩(wěn)定后進行以下實驗。 2．試劑配制及實驗分組：碘化鉀，分析純

2、，以純水配制成為1000mgT/L母液，避光保存，以DMEM培養(yǎng)液稀釋待用。碘，分析純，以純水配制成飽和溶液，以化學滴定法測定其濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。本實驗中，碘離子設1個空白對照組及50～15000μg/L中若干實驗組；碘分子設1個空白對照組及50～4000μg/L中若干實驗組。 3．細胞計數(shù)及形態(tài)學觀察：種24孔板，待細胞貼壁后加入不同濃度的碘離子及碘分子，每板均設對照組，于作用4、12、24、48小時后進行細胞計數(shù)及觀察細胞形態(tài)

3、學改變。 4．MTT：種96孔培養(yǎng)板，不同濃度碘離子及碘分子處理4、12、24、48小時后，每孔添加2μl(5mg/ml)MTT試劑，37℃孵育4小時，小心棄去培養(yǎng)液，每孔加入15μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10分鐘。以酶標儀在490nm波長下測其光吸收值(吸光度A值)，可間接反映細胞數(shù)量。 5．流式細胞術(shù)：不同濃度碘離子及碘分子處理細胞48小時，經(jīng)離心-PBS沖洗-吹勻-固定-再離心-沖洗-吹打-染色(4℃，20～

4、30分鐘)后，以400目尼龍網(wǎng)過濾后上機檢測。ModFit分析軟件分析，用細胞分裂增殖指數(shù)表示相對增殖活力。 6．免疫細胞化學：將潔凈無菌的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，制備單細胞懸液，種6孔板，以不同濃度的碘離子及碘分子處理48小時后取出蓋玻片，固定細胞，檢測細胞中Ki-67的表達。 7．SOD、MDA檢測：利用試劑盒對培養(yǎng)細胞的上清液中丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)進行檢測。 【結(jié)果】 1．細胞

5、計數(shù)及MTT檢測：碘離子濃度及碘分子濃度較低(如48小時：碘離子≤3000μg/L，碘分子≤400μg/L)時，細胞計數(shù)隨濃度增加而增加，細胞活性也隨濃度增加而升高；碘離子濃度及碘分子濃度較高(如48小時：碘離子≥3000μg/L，碘分子≥400μg/L)時，細胞計數(shù)隨濃度增加而減少，細胞增殖活性也隨濃度增加而降低，且可見細胞形態(tài)學改變。 2．流式細胞術(shù)：碘離子濃度100～4000μg/L(碘分子濃度50～700μg/L)實驗組

6、細胞增殖指數(shù)明顯高于對照組，同時細胞凋亡率明顯低于對照組；碘離子濃度5000μg/L(碘分子濃度800μg/L)實驗組細胞增殖指數(shù)與對照組比較沒有明顯差別，而細胞凋亡率明顯高于對照組；碘離子濃度≥6000μg/L(碘分子濃度≥900μg/L)實驗組細胞增殖指數(shù)明顯低于對照組，同時細胞凋亡率明顯高于對照組。 3．免疫細胞化學：碘離子濃度100～3000μg/L(碘分子濃度50-500μg/L)實驗組Ki-67的陽性率明顯高于對照組

7、；碘離子濃度≥5000μg/L(碘分子濃度≥700μg/L)各實驗組Ki-67的表達率明顯低于對照組。 4．SOD、MDA檢測：碘離子濃度50～600μg/L(碘分子濃度50～300μg/L)實驗組隨碘離子濃度的增加SOD含量增加，碘離子濃度800～10000μg/L(碘分子濃度600～4000Aμg/L)實驗組隨碘離子濃度的增加SOD含量減少；碘離子濃度50～800μg/L(碘分子濃度50-500μg/L除200μg/L外)各

8、實驗組MDA含量與對照組比較無明顯差別，碘離子濃度1000～10000μg/L(碘分子濃度700-400μg/L)各實驗組MDA含量與對照組比較明顯高于對照組。 【結(jié)論】 1．碘對成纖維細胞增殖活性具有促進和抑制兩方面的作用，其作用效果與作用時間作用濃度密切相關(guān)，即高碘對成纖維細胞增殖活性存在時間-劑量-效應關(guān)系。 2．初步分析碘主要是通過對成纖維細胞氧化-抗氧化體系、細胞周期和細胞凋亡的調(diào)控來影響成纖維細胞增殖