殼聚糖不對(duì)稱引導(dǎo)骨組織再生膜的研究.pdf

1、目的：
　　牙周炎及種植體周圍炎可導(dǎo)致牙周骨組織及種植體周圍骨組織進(jìn)行性的損壞從而導(dǎo)致牙齒脫落及種植體的失敗。引導(dǎo)骨組織再生技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)牙周骨組織的再生,其原理是利用膜材料作為隔離屏障，放置在牙周組織缺損處以阻擋牙齦上皮,防止其在愈合過(guò)程中沿根面的生長(zhǎng)，阻擋纖維結(jié)締組織與牙根表面接觸，為骨組織再生提供了生長(zhǎng)空間，其中引導(dǎo)組織再生膜起著至關(guān)重要的作用。本研究制備的殼聚糖不對(duì)稱引導(dǎo)骨再生膜包括致密層及疏松層，致密層可以阻止骨缺損周圍的

2、纖維結(jié)締組織浸潤(rùn)，疏松層可以改善骨細(xì)胞的粘附及血凝塊的穩(wěn)定性，從而實(shí)現(xiàn)骨組織再生。
　　引導(dǎo)組織再生技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)牙周骨組織的再生，但是細(xì)菌感染是導(dǎo)致引導(dǎo)組織再生手術(shù)失敗的最主要的原因。本研究還制備了膠原/殼聚糖載藥不對(duì)稱引導(dǎo)骨再生膜，該膜包括致密層及疏松層，致密層可以阻止骨缺損周圍纖維結(jié)締組織的入侵，疏松層可以提高骨細(xì)胞的粘附及穩(wěn)定血塊，同時(shí)載入廣譜抗菌藥物米諾環(huán)素，在促進(jìn)骨組織再生的同時(shí)能夠預(yù)防術(shù)后感染。
　　方法：

3、>　　(1)殼聚糖不對(duì)稱引導(dǎo)骨再生膜的制備及性能評(píng)估：殼聚糖醋酸溶液鋪膜后通過(guò)液氮萃取后進(jìn)行第一次冷凍干燥，隨后三聚磷酸鈉4℃交聯(lián)2 h，進(jìn)行第二次凍干得到殼聚糖不對(duì)稱膜。掃描電鏡觀察殼聚糖膜表面及斷面結(jié)構(gòu)特征；ATR-FTIR及XRD觀察交聯(lián)及未交聯(lián)殼聚糖膜的峰值，從而評(píng)估三聚磷酸鈉的交聯(lián)效果；通過(guò)機(jī)械性能、多孔性、降解性及通透率的測(cè)試來(lái)表征膜的物理性能；將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種在膜上，通過(guò)MTT及Live/Dead染色實(shí)驗(yàn)評(píng)估

4、膜的生物相容性；制備SD大鼠顱骨缺損模型，通過(guò)病理切片HE及Masson染色評(píng)估膜材料引導(dǎo)骨組織再生的能力。
　　(2)膠原/殼聚糖載藥不對(duì)稱引導(dǎo)骨再生膜的制備及性能評(píng)估：通過(guò)離子交聯(lián)法制備殼聚糖載米諾環(huán)素納米微球，將一定量的載藥微球與殼聚糖溶液共混后鋪膜，通過(guò)浸潤(rùn)沉淀法制得殼聚糖不對(duì)稱膜，將EDC/NHS交聯(lián)的膠原溶液鋪在殼聚糖不對(duì)稱膜的致密層，冷凍干燥制得膠原/殼聚糖載藥不對(duì)稱引導(dǎo)骨組織再生膜。掃描電鏡觀察膜材料的結(jié)構(gòu)特征；將

5、載藥與未載藥膜材料與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察抑菌效果；將成骨細(xì)胞 MC3T3-E1及成纖維細(xì)胞L929分別接種在材料疏松層及致密層，通過(guò)Live/Dead細(xì)胞染色激光共聚焦顯微鏡下評(píng)估細(xì)胞活性；將膜材料埋入小鼠皮下觀察毒性反映及降解性能；構(gòu)建SD大鼠顱骨缺損模型，并在4 w時(shí)進(jìn)行Mirco-CT及組織病理切片的觀察。
　　結(jié)果：
　　(1)掃描電鏡結(jié)果展示了殼聚糖不對(duì)稱膜的致密層及疏松層結(jié)構(gòu)；通過(guò)TPP交聯(lián)

6、的殼聚糖膜的ATR-FTIR能譜在1635cm-1及1215cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，XRD結(jié)果在20?(2θ)的波峰變的平緩；交聯(lián)的殼聚糖膜在干濕狀態(tài)下的拉伸強(qiáng)度分別為0.283Kgf/mm2和0.265Kgf/mm2；交聯(lián)的殼聚糖膜在體外降解28 d后降解率未達(dá)30％；通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察Live/Dead細(xì)胞染色，視野下沒(méi)有觀察到死細(xì)胞；組織病理切片看到該殼聚糖膜具有引導(dǎo)骨組織再生的能力。
　　(2)掃描電鏡結(jié)果可以看到

7、膠原面較致密而殼聚糖膜面疏松多孔具有明顯的不對(duì)稱性結(jié)構(gòu)，透射電鏡結(jié)果顯示載藥殼聚糖納米微球微球粒徑均一，大小在20nm左右；抑菌試驗(yàn)中，激光共聚焦顯微鏡觀察膠原/殼聚糖載藥不對(duì)稱引導(dǎo)骨組織再生膜表面沒(méi)有觀察到活菌的存在，而未載藥膜表面可見(jiàn)大量活菌；Live/Dead細(xì)胞染色可以看到疏松面MC3T3-E1成骨細(xì)胞及致密面L929成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)良好；材料埋入皮下4w可見(jiàn)明顯的降解，在降解的材料周圍可見(jiàn)新生血管；顱骨缺損修復(fù)4 w后進(jìn)行Mir