GSK-3β信號通路在慢性移植腎失功發(fā)病機制中的作用及其意義的研究.pdf

1、研究背景:
　　 腎移植是終末期腎臟病主要替代療法之一。隨著更新更有效的免疫抑制劑的應用和不斷完善，移植手術技巧的改進，組織配型、器官保存技術的提高，移植后早期急性排斥反應發(fā)生率較前明顯下降，而移植腎的長期成活仍然是醫(yī)學上的難題。目前研究數(shù)據(jù)表明，盡管移植腎1年存活率普遍可以達到90％水平，通常每年仍然有4～5％移植腎逐漸喪失，導致移植腎的5年存活率大概為70％，10年存活率僅為50％左右，最終面臨二次手術或血液透析治療。近期研

2、究發(fā)現(xiàn)，影響長期移植腎功能的主要因素是慢性移植腎失功。慢性移植腎失功臨床上主要表現(xiàn)無明顯誘因下出現(xiàn)蛋白尿和高血壓及伴有腎功能血肌酐爬行性上升，最終進展為終末期腎臟病。腎小球硬化、血管病變、腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化是慢性移植腎失功主要病變特征，而血管病變、腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化均與組織中淋巴細胞、漿細胞和肥大細胞浸潤相關。已有的研究結果證明慢性炎性反應是各種腎臟疾病中腎單位損傷的關鍵病理過程，包括慢性移植腎失功。
　　 最近的研究

3、揭示GSK-3β介導的炎性反應與移植腎功能的惡化相關，但其確切的機制仍未完全闡明。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，GSK-3β調(diào)節(jié)多種細胞反應，如細胞生長、分化、程序性死亡和炎性反應。GSK-3β參與多個信號通路，如GSK-3β與wnt、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、NF-κB等信號通路存在相關性[1]。GSK-3β最初被認為可作為糖代謝的調(diào)節(jié)酶

4、。后續(xù)的研究表明[2]，GSK-3β還涉及到其他細胞過程，如信號轉(zhuǎn)導、胰島素的作用、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、組織細胞骨架、細胞周期進程與生存。GSK-3β通過絲氨酸殘基磷酸化而失活，GSK-3β的底物需先預磷酸化，磷酸化后底物可提高GSK-3β與其酶促底物的磷酸化作用，從而增加GSK-3β的活性，即GSK-3β第9位的Ser(絲氨酸)位點磷酸化，可抑制GSK-3β的活性，進而通過相應的信號通路磷酸化下游底物而發(fā)揮其生物學功能。目前研究發(fā)現(xiàn)，GS

5、K-3β調(diào)控著促炎因子核因子κB(NF-κB)的活化，及NF-κB介導的趨化因子的表達。近年來一些研究揭示GSK-3β參與人和實驗模型中的炎癥性疾病，如急性腎衰竭、糖尿病腎病、慢性移植腎腎病。GSK-3β有促炎性反應的作用，GSK-3β是炎癥過程的一個主要因素，已在心理障礙、阿爾茨海默病、糖尿病、腫瘤中得到證實。GSK-3β促進炎性因子的產(chǎn)生和細胞遷移，在許多動物實驗模型中發(fā)現(xiàn)抑制GSK-3β的活性和炎性反應，對機體起到保護作用。因此，

6、抑制GSK-3β的活性可作為治療腎臟疾病的靶點。本研究主要檢測移植腎腎組織中GSK-3β的表達，并分析GSK-3β的表達與移植組織腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤、間質(zhì)纖維化、小管萎縮的關系，探討GSK-3β在慢性移植腎失功中作用。
　　 研究目的:
　　 研究慢性移植腎失功移植腎組織病理學特點。探討糖原合成酶激酶-3beta(GlycogenSynthasekinase-3beta)在移植腎組織中表達及意義。探討GSK-3beta在

7、慢性移植腎失功患者移植腎纖維化中的作用及機制，進一步闡明移植腎纖維化的分子病理機制，為臨床防治慢性移植腎失功提供相應的理論和新的思路。
　　 研究方法:
　　 臨床資料:
　　 收集181醫(yī)院2007年1月至2009年12月因蛋白尿或肌酐升高而行腎臟穿刺術的腎移植患者的腎穿標本。其中，符合慢性移植腎失功的病例有28例，其中男21例(45±10歲)，女7例(42±9歲)，患者為行同種異體腎移植術后1～9年而出現(xiàn)移植

8、腎功能減退者，平均腎移植時間為3.5年，28例患者中18例是接受CsA+MMF+Pred三聯(lián)免疫抑制治療方案，9例接受FK506+MMF+Pred方案治療，1例接受西羅莫司+嗎替麥考酚酯+潑尼松三聯(lián)免疫抑制治療方案。腎穿前通過彩超和血清藥物濃度(FK506、CsA)檢測，并根據(jù)病理結果，排除急性排斥反應、免疫抑制藥物腎毒性損傷、梗阻/返流、腎動脈或靜脈血栓或栓塞、及其他疾病。供、受者血型相同，淋巴細胞毒交叉配型試驗(CDC)＜10％，群

9、體反應性抗體(PRA)＜10％，HLAA、B、Dr位點至少有二個位點相配。以5例正常腎組織作為對照組(Normal組)，均為正常供體尸腎術前穿刺活檢標本，病理檢查無異常。33例標本均制成蠟塊，同時進行HE染色，PASM染色和Masson三色染色，同時行IgG、IgA、IgM、Clq和C4c免疫組化檢測，光鏡下觀察移植腎病理改變。
　　 病理分級:
　　 同時對移植腎組織標本按照最新的Banff2007移植腎病理分類標準進

10、行病理診斷及分級，將病理診斷為慢性移植腎失功，按炎癥細胞浸潤程度分為:腎小管間質(zhì)炎癥細胞浸潤情況分為輕度、中度和重度。輕度:少量炎癥細胞浸潤，呈散在分布(＜25％);中度:片狀或灶性炎癥細胞浸潤(26％～50％);重度:大量炎癥細胞浸潤(＞50％)。
　　 而無其他特殊病因的間質(zhì)纖維化或小管萎縮分為:Ⅰ級輕度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(＜25％的皮質(zhì)受累);Ⅱ級中度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(26％～50％的皮質(zhì)受累);Ⅲ級重度間質(zhì)纖維

11、化和腎小管萎縮(＞50％的皮質(zhì)受累)，可能包括非特異的血管和腎小球硬化但伴有重度小管間質(zhì)病變。
　　 圖像分析處理:
　　 所有標本均采用免疫組織化學ELiVisionTMplus二步法檢測腎組織中GSK-3beta的表達，圖像分析方法采用LeicaQwin高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(型號DMR+Q550)，通過光學顯微鏡放大400倍攝取并分析圖像。每例標本連續(xù)選取10個不重疊(避開腎小球和大血管)的腎小管間質(zhì)高倍視野

12、(×400，HPF)，觀察部位包括腎皮質(zhì)、皮髓交接處和髓質(zhì)部的腎小管間質(zhì)，每例腎小管總數(shù)大于60個，以細胞染成黃色為陽性，使用IPP(ImagePro-Plus)軟件測定累積光密度(IOD)和平均面積，IOD值越大提示免疫反應越強;測定視野中腎小管間質(zhì)陽性表達面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積(去除腎小管管腔)的比值，取其均值代表此例患者某種成分在腎小管間質(zhì)的相對含量。
　　 統(tǒng)計分析:
　　 統(tǒng)計學處理方法，采用SPSS13

13、.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，GSK-3beta的表達量進行方差齊性檢驗(Levene檢驗)后，方差齊性者采用單因方差分析(one-wayANOVA)比較各指標的組間差異，并采用LSD法進行兩組間的多重比較;方差不齊者則采用F檢驗Welch法進行比較，并采用Dunnett'T3法進行兩組間的多重比較，雙變量相關性采用(Spearman相關系數(shù))等級相關分析，取雙側，檢驗水平α=0.05，P≤0.05被認為有顯著性統(tǒng)計學差異。
　　

14、 結果:
　　 1.慢性移植腎失功移植腎病理組織學改變主要表現(xiàn)為:間質(zhì)纖維化和小管萎縮伴炎癥細胞(淋巴細胞和單核細胞)浸潤，部分小管擴張;腎小球基底膜增厚，呈雙軌征改變部分小球呈節(jié)段性硬化，腎小球系膜區(qū)增寬，部分系膜溶解;腎小管周圍毛細血管基底膜增厚;動脈內(nèi)膜增厚。不符合急性排斥反應、免疫抑制藥物腎毒性損傷、梗阻/返流、等其他疾病病理改變。
　　 2.腎小管間質(zhì)GSK-3β的表達通過免疫組織化學染色顯示，在正常腎臟組織，

15、無或僅有極少量GSK-3β表達，GSK-3β主要表達于腎小管上皮細胞胞漿中，多呈弱陽性表達;而在慢性移植腎失功移植腎組織中GSK-3β主要表達于腎小管上皮細胞和間質(zhì)細胞胞漿中較正常腎組織明顯增強，并隨腎組織炎癥細胞浸潤、間質(zhì)纖維化、小管萎縮程度而遞增(見表1、表2、圖1、圖2)。
　　 3、統(tǒng)計學分析結果顯示，GSK-3β在慢性移植腎失功組腎小管、間質(zhì)的表達比正常腎組織明顯增多，兩者間差異均有顯著性(P值均＜0.001)，GSK

16、-3β的表達(面積百分比(％)和IOD)隨慢性移植腎失功炎癥細胞浸潤程度和IF/TA病理分級的加重而呈增加的趨勢(分別為F=11.050，P=0.000和F=11.518，P=0.000及F=7.492，P=0.001和F=7.978，P=0.000)，但GSK-3β(％)在移植腎IF/TAⅡ級和Ⅲ級組間表達量差異不顯著(P＞0.05)，GSK-3β(IOD)在移植腎IF/TAⅠ級和IF/TAⅡ級組間及IF/TAⅡ級和Ⅲ級組間表達量差異

17、均不顯著(P＞0.05);經(jīng)等級相關分析，通過Image-Pro軟件分析，慢性移植腎失功患者移植腎組織中GSK-3β的IOD(累積光密度)值明顯高于正常腎組織，并與炎癥細胞浸潤和間質(zhì)纖維化/小管萎縮呈正相關(r=0.688和0.584，p＜0.05)。其值越大，提示小管間質(zhì)病變越重(圖3，4)。
　　 結論:
　　 1、慢性移植腎失功移植腎病理組織學改變主要表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤、腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮。
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