骨髓源肝血竇內皮祖細胞在大鼠ALPPS術后肝再生中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分：大鼠ALPPS手術模型的建立
　　目的：新興的聯(lián)合門靜脈結扎和肝臟離斷的二步肝切除術(ALPPS)能刺激肝臟快速再生，但具體機制尚未闡明。近年來的研究表明,骨髓源肝血竇內皮祖細胞(bone marrow derived liver sinusoidal endothelial progenitor cells，BM SPCs）的募集是肝再生的必要條件,而血管內皮細胞生長因子(v

2、ascular endothelial growth factor,VEGF)是這一過程的關鍵調控者。據此，我們推測BM SPCs可能在ALPPS術后肝再生中發(fā)揮著重要的作用。本課題，首先制備大鼠ALPPS術模型，經組織學、肝功能和免疫組化染色評估術后肝再生情況;然后通過免疫熒光染色、PCR和Western Blot方法，觀察BM SPCs在ALPPS術后肝組織中的募集情況以及VEGF的表達情況，來評估BM SPCs在ALPPS術后肝再

3、生中的作用。
　　方法：90只健康的SD雄性大鼠隨機分為ALPPS手術組、肝臟門靜脈結扎組（PVL組）和假手術組（Sham手術組），每組各30只各組設置1、2、3、5和7天五個時間點。ALPPS手術組采用門靜脈80％分支結扎以及原位離斷肝臟實質制作ALPPS大鼠模型，PVL組為80％門靜脈結扎大鼠，Sham組為僅開腹后翻動肝臟數(shù)次后即關腹。各組于各時相點處死動物取材，取肝組織和血清進行以下實驗：右中葉肝臟與大鼠體重比重的計算;HE

4、染色檢測肝組織病理變化，肝臟組織Ki-67免疫組化染色檢測肝臟細胞增殖情況;血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)和總膽紅素(TBIL)測定檢測肝功能狀況。
　　結果：(1)ALPPS手術組與PVL手術組相比，在各時相點肝臟生長率均顯著升高(p＜0.05)。(2)ALPPS手術組與PVL手術組相比，肝臟組織損傷更嚴重并可見Ki-67陽性細胞明顯增多。(3)ALPPS手術組與PVL手術組相比，血清ALT、AST和TBIL水平

5、在術后第一天顯著升高(p＜0.05)，第三天開始顯著下降并回到正常水平。
　　第二部分：BM SPCs在大鼠ALPPS術后肝再生中的作用研究
　　目的：評估BM SPCs在大鼠ALPPS術后在肝再生中的作用規(guī)律。
　　方法：在第一部分取材肝組織和血清的基礎上，采用免疫熒光染色檢測骨髓源肝血竇內皮祖細胞的表面標志物CD133、CD45和CD31的表達情況，通過PCR實驗檢測肝臟組織中的血清肝生長因子(HGF)和VEGF的

6、mRNA表達水平，并進一步用Western Blot方法檢測HGF和VEGF蛋白的表達情況。此外，測定了的HGF表達水平。
　　結果：(1)ALPPS手術后大鼠肝臟結扎側可見呈CD31+CD133+和CD45+CD133+陽性的骨髓源肝血竇內皮祖細胞，但是在ALPPS手術組肝臟保留側、PVL組和Sham組中均未見CD31+CD133+和CD45+CD133+陽性的細胞。(2)ALPPS組與PVL組相比，大鼠肝臟組織HGF mRNA

7、水平顯著升高，并且ALPPS手術后大鼠肝臟保留側HGF mRNA水平隨著術后時間的延長而逐漸下降，與此相反，肝臟結扎側HGF mRNA表達水平隨著時間的推移一直升高;隨后Western Blot方法進一步證實了HGF蛋白表達與其轉錄水平一致。(3)ALPPS組與PVL組相比，大鼠肝臟組織VEGF mRNA水平顯著升高，并且ALPPS手術后大鼠肝臟保留側VEGF mRNA水平隨著時間的推移一直下降，而肝臟結扎側VEGF mRNA表達水平在

8、術后第1天和第2天呈上升趨勢，并在第2天達到峰值，之后則隨著術后時間的延長而逐漸下降;隨后Western Blot方法檢測VEGF蛋白表達發(fā)現(xiàn)ALPPS手術后的第1、2天和3天中，肝臟保留側的VEGF蛋白水平一直是低于肝臟結扎側，并且肝臟保留側的VEGF蛋白水平在術后第1天和第2天呈下降趨勢，然而自第3天起VEGF蛋白水平反而開始上升;肝臟結扎側VEGF蛋白水平的表達與其轉錄水平一致。
　　結論：1、ALPPS術后肝組織再生顯著提