MiR-484靶向HIPK1促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展的研究.pdf

1、研究背景：
　　肝纖維化是指當(dāng)肝臟受到各類(lèi)有害因素的損傷時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)沉積而導(dǎo)致肝臟正常結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變的病理過(guò)程。多種慢性肝病均可經(jīng)此過(guò)程并最終進(jìn)展為預(yù)后極差的肝硬化和肝癌。所以，針對(duì)肝纖維化的早期診斷和治療成為研究的重中之重。而目前為止，肝穿刺仍為診斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其有創(chuàng)性而得不到廣泛、及時(shí)實(shí)施，在一定程度上耽誤了患者的早期診治。雖已有肝纖維化無(wú)創(chuàng)性早期診斷的方法，但

2、均不十分理想，新的更有效的手段亟待被發(fā)現(xiàn)，這就有必要對(duì)肝纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制行進(jìn)一步深入研究。
　　miRNA(microRNA)是一段大小約20～25個(gè)核苷酸序列的小分子片段，其在真核細(xì)胞中廣泛存在，可通過(guò)負(fù)向調(diào)控其靶基因參與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展，且在內(nèi)分泌、心血管和腫瘤等多種研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。目前亦有多種研究表明miRNA與肝纖維化發(fā)生密切相關(guān)，其可通過(guò)影響肝星狀細(xì)胞(hepatic stellated cell，HS

3、C)的活化、增殖、凋亡、遷移等細(xì)胞學(xué)功能，在肝纖維發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中起促進(jìn)或抑制作用。本課題組多年來(lái)一直從事miRNAs與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究，前期工作發(fā)現(xiàn):miR-484在DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中呈顯著性差異表達(dá)，且相關(guān)文章已經(jīng)發(fā)表。本研究為進(jìn)一步探討miR-484是否對(duì)HSC細(xì)胞功能學(xué)產(chǎn)生影響，通過(guò)提取原代HSC，檢測(cè)到miR-484在HSC自然活化過(guò)程中表達(dá)呈上升趨勢(shì)。并通過(guò)生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)篩選并驗(yàn)

4、證得知HIPK1（homeodomain interacting protein kinase1，同源結(jié)構(gòu)域交互蛋白激酶1）為miR-484的靶基因。已有研究表明，HIPK1可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物過(guò)程。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)miR-484可通過(guò)靶向HIPK1促進(jìn)HSC活化并抑制其凋亡，且在此過(guò)程中伴有Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，若在疾病早期對(duì)miR-484的表達(dá)進(jìn)行抑制，或許可阻遏肝纖維化進(jìn)程。
　　研究目的

5、：
　　本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，旨在進(jìn)一步探討miR-484參與肝纖維化形成的具體分子機(jī)制。共包括三個(gè)部分:（一）檢測(cè)miR-484在大鼠原代HSC自然活化過(guò)程中的表達(dá)變化;（二）miR-484靶基因的篩選及驗(yàn)證;（三）miR-484對(duì)HSC活化和凋亡的信號(hào)通路機(jī)制研究。
　　研究方法：
　　一、檢測(cè)miR-484在大鼠原代HSC自然活化過(guò)程中的表達(dá)變化
　?。ㄒ唬┨崛〈笫笤鶫SC，以自發(fā)熒光實(shí)驗(yàn)鑒定所提細(xì)胞

6、的純度;將培養(yǎng)2天內(nèi)的細(xì)胞作為靜止態(tài)，培養(yǎng)至14天的細(xì)胞作為完全活化態(tài)，并用免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞狀態(tài);
　?。ǘ﹒RT-PCR檢測(cè)原代細(xì)胞不同時(shí)期miR-484的表達(dá)水平。
　　二、 miR-484靶基因的篩選及驗(yàn)證
　?。ㄒ唬┮詍iR-484為關(guān)鍵詞，在microRNA.org、 miRbase、TargetScan等網(wǎng)站進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)，并對(duì)感興趣的靶基因進(jìn)行Gene ontology(GO)分析，發(fā)掘其可能參與

7、的功能;
　　（二）雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-484與HIPK1之間是否存在直接靶向關(guān)系。
　　（三）利用HSC-T6細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將miR-484 inhibitor/mimics及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入細(xì)胞48h后，提取細(xì)胞總蛋白。利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)HIPK1是否被miR-484負(fù)向調(diào)控;
　　三、 miR-484對(duì)HSC活化和凋亡的信號(hào)通路機(jī)制研究
　?。ㄒ唬┰贖SC-T6細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染

8、miR-484 inhibitor后，qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)不同分組之間肝纖維化相關(guān)指標(biāo)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和Ⅰ型膠原(TypeⅠ collagen，colI)表達(dá)變化;
　?。ǘ┰贖SC-T6細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miR-484 inhibitor后，利用qRT-PCR和WesternBlot技術(shù)檢測(cè)Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin表達(dá)是否發(fā)生相

9、應(yīng)改變，以檢測(cè)miR-484對(duì)HSC細(xì)胞功能的調(diào)控，是否通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn);
　　（三）AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法用以檢測(cè)不同分組之間細(xì)胞凋亡的差異。
　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;兩組數(shù)據(jù)之間比較采用T檢驗(yàn);統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS21.0;統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性定義為P＜0.05。
　　研究結(jié)果：
　　一、 miR-484在大鼠原代HSC自然活化過(guò)程中的表達(dá)變化

10、　?。ㄒ唬┳园l(fā)熒光實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果提示所提原代HSC的純度可達(dá)90％以上，2天內(nèi)靜止態(tài)的細(xì)胞呈橢圓形，脂質(zhì)含量豐富，在328 nm波長(zhǎng)紫外光照射下，可發(fā)射出黃綠色熒光;培養(yǎng)至14天達(dá)到完全活化狀態(tài)，細(xì)胞延展生長(zhǎng)，呈星狀;免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示活化態(tài)細(xì)胞中α-SMA表達(dá)量明顯升高;
　?。ǘ﹒RT-PCR結(jié)果提示，相對(duì)于靜止態(tài)，活化態(tài)HSC中miR-484表達(dá)呈顯著性升高(P＜0.05)。
　　二、 miR-484靶基因的篩選與驗(yàn)證<

11、br>　?。ㄒ唬┥镄畔W(xué)分析結(jié)果提示，HIPK1與miR-484在3'UTR區(qū)域存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn);
　?。ǘ╇p熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-484與HIPK1之間確實(shí)存在靶向關(guān)系;
　?。ㄈ￤estern Blot結(jié)果表明，在HSC-T6細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miR-484 inhibitor后，HIPK1在蛋白水平表達(dá)明顯上調(diào);而轉(zhuǎn)染miR-484 mimics后，HIPK1在蛋白水平表達(dá)明顯下調(diào)。
　　三、 miR-48

12、4對(duì)HSC活化和凋亡的信號(hào)通路機(jī)制研究
　　（一）相對(duì)于陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-484 inhibitor后48h，HSC-T6細(xì)胞株中α-SMA和colI在mRNA和蛋白水平表達(dá)均明顯下降(P＜0.05);而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組表達(dá)則無(wú)明顯差異(P＞0.05);
　?。ǘ┺D(zhuǎn)染miR-484 inhibitor后，Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子Wnt-3a、 Wnt-5a、β-catenin表達(dá)下降(P＜0.

13、05);
　　（三）人為下調(diào)miR-484后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)得HSC-T6細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　一、 miR-484在原代HSC自然活化過(guò)程中表達(dá)升高;
　　二、 HIPK1是miR-484的直接靶基因;
　　三、 miR-484靶向HIPK1促進(jìn)HSC活化并抑制其凋亡，使得細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，促進(jìn)肝纖維化形成及進(jìn)展;
　　四、 miR-484靶向HIPK1對(duì)HSC細(xì)胞