肝纖維化發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)過程中kupffer細胞表型的研究.pdf

1、Kupffer細胞(KCs)是位于肝竇狀隙內(nèi)的一類非實質(zhì)細胞,是機體內(nèi)單核-巨噬細胞系的成員,屬于定居于肝內(nèi)的巨噬細胞,雖只占肝細胞總數(shù)的15％左右,但占單核-巨噬細胞系總數(shù)的80%-90%,它們主要位于小葉門靜脈區(qū),起重要的防御功能。KCs在生理和病理條件下都具有重要功能,針對KCs的相關(guān)實驗研究越來越引起人們的重視。KCs不僅能非特異的吞噬和清除血液中的細菌、外源性異物等抗原性物質(zhì),而且還具有特異性的免疫應(yīng)答、抗腫瘤免疫反應(yīng)、內(nèi)毒素

2、解毒、抗感染、調(diào)節(jié)微循環(huán)及物質(zhì)代謝等方面的作用。病理條件下,KCs可被內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等激活,釋放TNF、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)、干擾素(IFN)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、氧自由基(oxygenfree radical,OFR)、一氧化氮等炎性介質(zhì),這些炎性介質(zhì)均參與了肝損傷的發(fā)生與發(fā)展。KCs是一類異

3、質(zhì)性非常強的巨噬細胞,在不同的微環(huán)境條件下具有不同的表型,即KCs可分為多種亞型,且功能不同。目前公認的巨噬細胞亞群主要為M1型和M2型兩大類。在Th1型細胞因子(例如γ—IFN、TNF-α)作用下,巨噬細胞極化成經(jīng)典激活的巨噬細胞(CAMφ),即M1型巨噬細胞。而在Th2型細胞因子(例如IL4/IL13)作用下,極化成選擇性激活的巨噬細胞(AAMφ),即M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞的主要功能是清除細胞外病原體和促進炎癥反應(yīng),合成和分

4、泌TNF-α、IL-1、IL-6等促炎細胞因子,通過iNOS將精氨酸代謝成NO來殺滅病原體。而M2型巨噬細胞的主要功能是抑制炎癥反應(yīng)和參與組織修復(fù),合成和分泌抗炎細胞因子IL-10以及通過精氨酸酶-1將精氨酸分解成聚胺,參與合成和穩(wěn)定細胞外基質(zhì),且近年來也有人提出M2型KCs又可分為M2a、M2b及M2c三種亞型。但是在肝纖維化動物模型中,體內(nèi)KCs亞群的分類還不清楚。
　　肝纖維化是由持續(xù)性損傷-修復(fù)反應(yīng)引起的,導(dǎo)致肝組織內(nèi)細胞

5、外基質(zhì)異常沉積,進一步引發(fā)肝臟結(jié)構(gòu)和肝功能異常改變的一種病理過程,屬于肝硬化的早期階段,已有大量研究表明肝纖維化在去除損傷因素后是可以逆轉(zhuǎn)的。肝星狀細胞作為主要的效應(yīng)細胞,合成和分泌各種膠原和細胞外基質(zhì),一直被認為是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。然而,已有研究者發(fā)現(xiàn)巨噬細胞作為主要的調(diào)節(jié)細胞,能同時調(diào)節(jié)肝星狀細胞的功能和基質(zhì)膠原的降解。在肝纖維化形成過程中,巨噬細胞激活靜息狀態(tài)的肝星狀細胞促進肝纖維化的形成,在肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中,促使活化

6、的肝星狀細胞凋亡和纖維膠原的降解,促進肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。目前已有研究表明在肝纖維化發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)中的雙向調(diào)節(jié)作用是由不同的巨噬細胞亞群調(diào)控的,但是關(guān)于巨噬細胞亞群的分類在動物模型體內(nèi)還沒有系統(tǒng)的研究,而肝臟巨噬細胞(KCs)在肝纖維化中的作用越來越受到關(guān)注。我們的研究目的是找到何種表型的KCs分別在肝纖維形成期和逆轉(zhuǎn)期中發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用,為深入研究KCs在肝纖維化疾病中的分子機制奠定基礎(chǔ)。肝纖維化的深入研究對預(yù)防和緩解肝纖維化病情具有重要

7、的臨床意義。
　　我們首先建立流式細胞術(shù)同步分選KCs亞型細胞方法,通過多種細胞表面特異標志物的聯(lián)合使用區(qū)分各亞型細胞,并同時獲得這些亞型細胞。流式分選后KCs(F4/80+)得率為(1.26±0.24)×106/小鼠,純度為(97.6±0.7)%,LSEC(CD146+)污染度為(0.5±0.3)%,T淋巴細胞(CD3+)污染度小于0.5%,細胞純度、活性及得率均能滿足后續(xù)體外功能驗證研究和進一步的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。然后建立CCl

8、4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型,分離純化急性炎癥期、肝纖維化形成期及逆轉(zhuǎn)期的KCs,應(yīng)用流式細胞術(shù)分析各時期KCs表達的表面標志物的差異,應(yīng)用qRT-PCR檢測各時期KCs中炎性細胞因子和纖維化相關(guān)的細胞因子的表達差異,以確定各時期KCs的表型。第一次注射CCl4后,小鼠血清中ALT和AST水平顯著升高,尤其是注射后48h時達到最大值,HE染色顯示炎性細胞數(shù)目顯著增加,肝細胞氣球樣變性,損傷嚴重,Masson染色顯示膠原纖維含量沒有增加。實驗

9、結(jié)果表明第一次注射CCl4后,小鼠肝臟中發(fā)生嚴重的急性損傷反應(yīng),導(dǎo)致大量肝細胞壞死。連續(xù)注射CCl4的過程中,血清中ALT和AST水平逐漸升高但低于急性損傷期,肝臟中膠原纖維含量逐漸增加,肝組織中α-SMA表達量也逐漸增加,并伴隨著慢性炎癥反應(yīng),表明CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型構(gòu)建成功。停止注射CCl4后,隨著自然恢復(fù)時間的延長,血清中ALT和AST水平逐漸恢復(fù)正常水平,肝組織中α-SMA表達量也顯著下降,接近正常小鼠表達水平,膠原纖維

10、雖然消除緩慢,但在自然恢復(fù)6周(R6W)時各項指標均接近正常水平。說明停止注射CCl4后,肝纖維化小鼠發(fā)生自然恢復(fù)反應(yīng)且可以自然恢復(fù)到接近正常水平,如果自然恢復(fù)時間再延長,可以恢復(fù)到正常水平。
　　肝纖維化模型構(gòu)建成功后,通過檢測肝內(nèi)KCs的數(shù)量變化和細胞因子表達情況確定KCs參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)過程。肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中肝內(nèi)KCs數(shù)量顯著增加,肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中肝內(nèi)KCs數(shù)量逐漸減少,趨向與正常。KCs通過分泌不同的細胞

11、因子在肝纖維化發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)過程中實現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)作用。實驗結(jié)果表明急性炎癥期肝內(nèi)固有KCs(CD45+F4/80hi)主要功能是募集肝外單核細胞進入肝臟,表達炎性細胞因子,促進炎癥反應(yīng),導(dǎo)致肝損傷,而肝外來源的KCs(CD45+F4/80low)主要功能是促進肝星狀細胞活化和表達纖維化相關(guān)細胞因子促進肝纖維化發(fā)生發(fā)展;正常肝臟KCs是M2b型;肝纖維化發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)過程中發(fā)揮主要作用的KCs表型不同,存在各亞型KCs的表型轉(zhuǎn)換;急性炎癥期

12、、肝纖維化形成過程中、肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中發(fā)揮主要作用的KCs分別是M1型、M2c型、M2a型。我們首次系統(tǒng)地研究了生理條件下和肝纖維化發(fā)生、發(fā)展及逆轉(zhuǎn)過程中KCs表型的鑒定,并發(fā)現(xiàn)不同表型的KCs之間存在表型的轉(zhuǎn)換,初步明確不同時期KCs的表型,為進一步研究引起發(fā)揮不同生物學(xué)功能的KCs表型轉(zhuǎn)變的分子機制以及進一步開發(fā)抗纖維化治療新靶點提供研究基礎(chǔ),對肝纖維化的治療具有重要的臨床意義。但是本研究僅描述了在肝纖維化不同時期發(fā)揮不同生物學(xué)功