伯基特淋巴瘤中JAK2磷酸化TOPK的作用機(jī)制及中國(guó)人熱點(diǎn)基因突變的研究.pdf

1、背景:
　　伯基特淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma，BL）是一種侵襲性極高的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，多發(fā)生在4-7歲的兒童，男女比例約為2:1。腫瘤細(xì)胞常出現(xiàn)特征性的MYC基因轉(zhuǎn)位及EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染。大部分患者經(jīng)過(guò)一線(xiàn)治療方案治療后效果良好，但血清乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）明顯升高、出現(xiàn)并發(fā)癥及發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期的患者療效較差。對(duì)于難治性BL尚

2、無(wú)很好的治療方案，因此亟需對(duì)其高增殖等特點(diǎn)的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，以尋找新的治療靶點(diǎn)及方案。早在1994年就有研究者在BL中檢測(cè)到了高表達(dá)的T-LAK細(xì)胞起源的蛋白激酶（T-LAK cells originated protein kinase，TOPK），這是一種與腫瘤細(xì)胞周期、增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡密切相關(guān)的蛋白激酶。但目前TOPK在BL中的研究?jī)H局限在發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)的現(xiàn)象，至于TOPK在BL中高表達(dá)的原因和機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。隨著近些年基因組學(xué)

3、的迅速發(fā)展，國(guó)外一些學(xué)者在BL中檢測(cè)到了一些熱點(diǎn)基因的突變，但這些研究均來(lái)自西方國(guó)家，我國(guó)BL患者的熱點(diǎn)基因突變情況尚無(wú)相關(guān)研究。
　　目的:
　　1.了解BL患者的臨床特征，包括LDH水平、淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比值（Lymphocyte-to-monocyte ratio，LMR）的水平、Ann Arbor臨床分期、國(guó)際預(yù)后指數(shù)（International prognostic index，IPI）、治療方式及預(yù)后等情況。<

4、br>　　2.了解TOPK在BL中的表達(dá)情況，明確在BL中兩面神激酶2（Janus Kinase2，JAK2）磷酸化TOPK的作用機(jī)制。
　　3.了解中國(guó)人BL中的熱點(diǎn)基因：ID3、TCF3及MYC基因的突變情況。
　　方法:
　　1.收集35例BL病例的一般資料、臨床特征、實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù)，并對(duì)患者進(jìn)行隨訪，了解其預(yù)后。對(duì)收集整理的結(jié)果進(jìn)行分析、歸納，總結(jié)出BL患者的臨床特點(diǎn)及其與預(yù)后的關(guān)系。
　　2.（1）利用

5、免疫組化技術(shù)進(jìn)行TOPK、p-JAK2、p-STAT3、p-ERK1/2等抗體的免疫組化染色，并將組化結(jié)果與對(duì)應(yīng)病例的預(yù)后做生存分析。（2）由PEPTIDE2.0(Houston, TX,USA)公司合成并設(shè)計(jì)包含TOPK不同酪氨酸位點(diǎn)的肽段，利用活化的JAK2激酶進(jìn)行體外激酶試驗(yàn)，觀察可被JAK2磷酸化的TOPK的位點(diǎn)。（3）利用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在3株BL細(xì)胞系Daudi、P3HR1和Raji中，TOPK及JAK2的表

6、達(dá)情況。（4）利用體外結(jié)合試驗(yàn)觀察在體外及BL細(xì)胞系中JAK2和TOPK是否可以相互結(jié)合。（5）利用JAK2的激活劑IL-6及其抑制劑AG490觀察該途徑對(duì)TOPK磷酸化的影響。
　　3.用QIAGEN試劑盒提取保留完整的32例BL患者的石蠟組織DNA。利用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)擴(kuò)增ID3基因的外顯子1，TCF3基因的外顯子17以及MYC基因的全部3個(gè)外顯子，產(chǎn)物進(jìn)行電泳純化

7、并測(cè)序。
　　結(jié)果:
　　1.35例BL病例中，男女比例約為3：1，未成年（＜18歲）患者有13例（37.1％）。中位發(fā)病年齡為22（1-74）歲，其中有效隨訪人數(shù)為20例，5年生存率為51%。高臨床分期、高血清LDH、低LMR（<3.57）、高IPI指數(shù)、治療方式包含手術(shù)提示患者預(yù)后不良。
　　2.在35例BL患者中TOPK表達(dá)均呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性，27例p-JAK2表達(dá)陽(yáng)性，9例p-STAT3表達(dá)陽(yáng)性，p-ERK1/2在

8、35例病例中表達(dá)均為陰性；體外激酶實(shí)驗(yàn)觀察到JAK2可以磷酸化TOPK第74位的酪氨酸（Tyr74）；Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到在Daudi細(xì)胞中TOPK及JAK2的表達(dá)均高于P3HR1及Raji細(xì)胞；體外結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)無(wú)論在體外還是Daudi細(xì)胞內(nèi)JAK2和TOPK均可以相互結(jié)合；JAK2的激活劑IL-6及其抑制劑AG490可分別使TOPK Y74位點(diǎn)的磷酸化水平升高或降低。
　　3.我國(guó)32例BL患者的ID3、TCF3及

9、MYC突變率與西方文獻(xiàn)報(bào)道相似，分別為35.5%、18.8%和50.0%。我們還首次發(fā)現(xiàn)了TCF3基因及MYC基因的兩個(gè)重現(xiàn)性的突變位點(diǎn):TCF3突變，C.2202G＞C p.L569V；MYC突變，C.1070A＞G p.G182D。新突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，為解釋BL發(fā)生的分子機(jī)制提供了新的信息。
　　結(jié)論:
　　1.我國(guó)的BL患者中男性占大多數(shù)，人群主要為成年人，確診患者大多已到疾病晚期，且并發(fā)癥較多，5年生存率為51%。高臨

10、床分期、高血清LDH、低LMR（LMR<3.57）、高IPI指數(shù)、治療方式包含手術(shù)提示BL患者預(yù)后不良。
　　2.JAK2在BL中可以激活TOPK的Y74位點(diǎn)，提示JAK2可能通過(guò)在腫瘤細(xì)胞有絲分裂中發(fā)揮重要作用的絲/蘇氨酸激酶TOPK影響B(tài)L細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　3.我國(guó)BL的熱點(diǎn)突變基因ID3、TCF3及MYC基因的突變率與西方國(guó)家相似。我們首次發(fā)現(xiàn)了TCF3基因的突變位點(diǎn)：C.2202G＞C p.L