家族性骨髓增殖性疾病中JAK2基因突變的檢測(cè)及意義.pdf

1、研究背景和目的： (1)慢性骨髓增殖性疾病(Chronicmyeloproliferativedisorders，MPD)是以骨髓中一系或多系髓系細(xì)胞增殖為特征的克隆性造血干細(xì)胞的疾病，經(jīng)典MPD包括真性紅細(xì)胞多癥(PV，polycythemiavera)、特發(fā)性血小板增多癥(ET，essentialthrombocythemia)、慢性特發(fā)性骨髓纖維化(IMF，idiopathicMyelofibrosis)、慢性髓細(xì)胞白血病

2、(CML，chrorlicmyelogenousleuKemia)。(2-5)目前研究認(rèn)為酪氨酸蛋白激酶(PTK，proteintyrosinekinase)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的過(guò)度激活是MPD重要的發(fā)病機(jī)制，而除了CML具有特征性的Ph染色體和BCR/ABL融合基因外，PV、ET、IMF等其它Ph染色體陰性疾病的發(fā)病機(jī)制目前仍不明確。(8-11)JAK2基因是定位于9號(hào)染色體上的一種胞質(zhì)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，屬于JAKS家族，在細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)

3、導(dǎo)中起重要作用。2005年，有學(xué)者(12-15)先后發(fā)現(xiàn)在Ph染色體陰性MPD的絕大多數(shù)PV及部分ET、IMF患者中存在一種高致病性的獲得性突變-酪氨酸激酶JAK2V617F，研究發(fā)現(xiàn)JAK2突變的發(fā)生率在PV患者中為74％-97％，ET為33％-57％，IMF為35％-50％，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓實(shí)驗(yàn)(1，19-21)實(shí)可引起類(lèi)似PV的一些臨床表現(xiàn)，提示JAK2基因突變?cè)贛PD的發(fā)病中可能起重要作用。但對(duì)于JAK2V617F突變?cè)贛P

4、D發(fā)病中的確切作用及機(jī)理，目前仍未有較為統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。另外JAK2V617F突變陰性的MPD，是否與(37-40)MPLW515L/K突變有關(guān)?是否存在JAK2v617F突變之外的JAK2基因的其它點(diǎn)突變?這些都是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。 MPD患者大部分為散發(fā)性的個(gè)體發(fā)病，有關(guān)家族性MPD發(fā)病的相關(guān)報(bào)道較少見(jiàn)。(6，57)家族性骨髓增殖性疾病(FamilialMPD)通常包括兩種不同的血液系統(tǒng)疾病，一種是由于血小板生成素(54-54)(

5、TPO，thrombopoietin)及其受體(58)(thrombopoietinreceptor，c-mpl)基因(55，63)突變引起的原發(fā)性血小板增多癥，以及由于紅細(xì)胞生成素(56-57)(EPO，erythropoietin)受體基因突變所致的原發(fā)性紅細(xì)胞增多癥。這部分患者大多為先天性發(fā)病，家族成員中所有患者均表現(xiàn)為血小板增多或者紅細(xì)胞增多。目前已經(jīng)證實(shí)一些相關(guān)的致病性基因(TPO、EPO)突變的存在；同一家族中出現(xiàn)二例及二例

6、以上骨髓增殖性疾病患者也稱為家族性骨髓增殖性疾病，其疾病亞型可以相同，也可以表現(xiàn)為不同類(lèi)型的MPD(6)。研究顯示，JAK2V617F突變不僅存在于散發(fā)性的部分MPD患者中，也存在于家族性MPD患者中。由于家族性MPD的發(fā)病率并不高，目前有關(guān)研究國(guó)外報(bào)道不多，而國(guó)內(nèi)未見(jiàn)家族性骨髓增殖性疾病中JAK2V617F突變的相關(guān)報(bào)道。 本研究主要以2例先后在我院住院的同胞兄弟MPD患者及該家族其余成員為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)、P

7、ER產(chǎn)物DNA直接測(cè)序及限制性內(nèi)切酶方法進(jìn)行JAK2V617F突變檢測(cè)及其它相關(guān)檢查，了解在該家族成員中JAK2V617F突變的發(fā)生情況，以進(jìn)一步了解JAK2V617F突變?cè)谠摷易逯惺欠翊嬖诩易暹z傳性，同時(shí)我們對(duì)部分JAK2V617F突變陰性的MPD患者中MPLW515L/K突變、家族性紅細(xì)胞增多癥中EPOR基因突變及家族性血小板增多癥中TPO、c-mpl基因突變進(jìn)行檢測(cè)，以了解這些突變?cè)谠摷易逯械陌l(fā)生情況，為進(jìn)一步了解、闡述家族性骨髓

8、增殖性疾病的發(fā)生機(jī)制，以及可能的遺傳方式及在提供理論依據(jù)。 研究方法： 1.該家族成員進(jìn)行外周血標(biāo)本采集，并行血常規(guī)及流式細(xì)胞學(xué)檢查(主要包括CD34、CD41、CD61、CD71、CD117、GPA)，了解家族成員的血常規(guī)基本情況及外周血細(xì)胞中紅系、及巨核系及淋巴細(xì)胞亞群等相關(guān)分化抗原指標(biāo)表達(dá)情況。 2.必要時(shí)行骨髓細(xì)胞形態(tài)檢查和骨髓組織活檢病理學(xué)檢查。 3.通過(guò)溶解紅細(xì)胞方法分離外周血有核細(xì)胞，并提取

9、DNA，并參考文獻(xiàn)(13-17)以包括JAK2基因V617密碼子位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，普通PCR方法擴(kuò)增目的基因，電泳確定擴(kuò)增目的條帶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后用BsaXI限制性內(nèi)切酶消化。 4.PCR聯(lián)合測(cè)序方法探討部分JAK2V617F陰性的ET及IMF患者中是否存在另一種獲得的功能性基因突變-MPLW515L/K。 5.在家族遺傳性血小板增多癥家庭成員中，應(yīng)用PCR、DNA測(cè)序的方法，對(duì)所有家族成員進(jìn)行TPO、c-mpl基因

10、突變的檢測(cè)，特別是針對(duì)兩位血小板明顯升高的成員及其后代家族成員。 6.檢測(cè)家族成員中有關(guān)EPOR基因常見(jiàn)突變的檢測(cè)，特別是PV患者及其后代家庭成員，了解在這些家族成員中是否存在這些致病性的基因突變。 結(jié)果： 1.我們首先對(duì)二例家族性骨髓增殖性疾病患者及其家族其余成員進(jìn)行血常規(guī)及外周血流式細(xì)胞學(xué)檢查，了解成員血常規(guī)基本情況及外周血細(xì)胞表面紅系、巨核系等分化抗原表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)家族中除了兩位MPD患者外，多個(gè)成員血

11、細(xì)胞計(jì)數(shù)或位于正常值或高于正常值。另有一位家族成員檢查血常規(guī)示血小板明顯高于正常水平，同時(shí)流式細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果也發(fā)現(xiàn)相關(guān)表面抗原的異常表達(dá)，并且結(jié)合骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓組織病理學(xué)診斷為該家族中第三個(gè)MPD患者。 2.結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該家族中有三位成員為JAK2V617F突變陽(yáng)性，包括二例MPD患者，(ET及PV各一例)，一例為其父親，白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高但無(wú)臨床表現(xiàn)，因其拒絕行骨髓穿刺及其它相關(guān)檢查，診斷尚不明確。通過(guò)調(diào)查我們發(fā)現(xiàn)，三例患

12、者均為男性，且在二代家庭成員中發(fā)病，是否該家族中所有男性均可能出現(xiàn)JAK2V617F突變，我們重點(diǎn)對(duì)家族第三代成員中的二例男性青少年成員進(jìn)行JAK2V617F突變檢測(cè)，但未能在這二例成員中發(fā)現(xiàn)該突變。而另一例血小板明顯高于正常水平的女性成員被診斷為JAK2V617F突變陰性的MPD。 3.在一些JAK2V617F突變陰性的ET及IMF患者存在的MPLW515L/K突變?cè)谠摷易宄蓡T中也為陰性，并且家族遺傳性血小板增多癥存在的c-m

13、pl基因突變(TPO基因突變檢測(cè)部分目前正在實(shí)驗(yàn)中)及家族遺傳性紅細(xì)胞增多癥中存在的EPOR基因突變均未能在該家族的成員發(fā)現(xiàn)。 結(jié)論： 結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示在該家族中可能存在某種遺傳易感性使得這些成員更容易發(fā)生MPD以及有必要對(duì)該家庭成員定期進(jìn)行血常規(guī)及其它相關(guān)檢查，了解是否有向MPD發(fā)展的趨勢(shì)。本研究對(duì)一家族性MPD的家庭成員進(jìn)行調(diào)查及研究，為我們更好的了解JAK2V617F、MPLW515L/K、TPO、c-mpl、E

14、POR等這些在MPD(包括散發(fā)性及家族性)常見(jiàn)的基因突變?cè)谠摷易逍訫PD的成員中的發(fā)生情況，以進(jìn)一步了解這些突變?cè)诩易逍訫PD發(fā)病機(jī)制中的作用，為進(jìn)一步闡明Ph-MPD的發(fā)病機(jī)理、治療提供一些理論依據(jù)，特別是在疾病的早期發(fā)現(xiàn)、診斷、預(yù)防等方面。由于國(guó)內(nèi)未見(jiàn)家族性骨髓增殖性疾病中JAK2V617F突變的相關(guān)報(bào)道，因此本研究在國(guó)內(nèi)處于領(lǐng)先水平。 展望： 我們將對(duì)整個(gè)JAK2基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)直接測(cè)序了解在該家族中JA