迷走神經(jīng)電刺激對(duì)大鼠MCAO-再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討.pdf

1、背景與目的：近年靜脈溶栓的普及和血管內(nèi)治療的開展，給缺血性卒中患者帶來希望。但血管再通后繼發(fā)的再灌注損傷可導(dǎo)致腦損傷和功能損害進(jìn)一步加重。目前認(rèn)為，干預(yù)腦缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion, I/R）對(duì)于缺血性腦卒中的防治具有重要的意義。迷走神經(jīng)電刺激（vagus nerve stimulation,VNS）早在1997年通過美國食品和藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)，應(yīng)用于臨床治療難治性癲癇患者。近年國內(nèi)外研究顯示，VNS對(duì)大鼠腦

2、 I/R損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。國外一項(xiàng)臨床試驗(yàn)已經(jīng)表明，VNS聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練治療上肢無力的缺血性腦卒中患者是可行的。然而，關(guān)于VNS對(duì)缺血性腦卒中的具體保護(hù)機(jī)制，國內(nèi)外仍缺乏系統(tǒng)而深入的研究。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白型前列腺素D合成酶（Lipocalin-type prostaglandin D synthase, L-PGDS）是一種雙功能蛋白質(zhì)，具有催化前列腺素D2合成和轉(zhuǎn)運(yùn)親脂性物質(zhì)的作用。L-PGDS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerou

3、s system, CNS）中表達(dá)量豐富，并有益于保護(hù)腦缺血損傷。但L-PGDS在CNS特別是缺血性腦卒中中的作用機(jī)制不明。本研究擬通過VNS干預(yù)對(duì)大鼠腦I/R損傷后凋亡、炎癥反應(yīng)及血腦屏障的影響及可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討，并觀察 L-PGDS表達(dá)變化在其中的作用，為缺血性腦卒中的治療提供新思路。
　　方法：
　　第一部分：采用大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/rep

4、erfusion, MCAO/R）模型，ELISA和Western blot技術(shù)檢測L-PGDS在再灌注后12h，24h，3d及7d的表達(dá)變化。免疫熒光雙標(biāo)檢測L-PGDS在缺血半暗帶區(qū)的表達(dá)定位。構(gòu)建慢病毒shRNA-L-PGDS沉默L-PGDS表達(dá)，采用激光共聚焦檢測綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）的表達(dá)以明確慢病毒是否轉(zhuǎn)染成功；采用熒光定量PCR檢測慢病毒載體對(duì)大鼠腦內(nèi)L-PGDS mRN

5、A的干擾效率。慢病毒轉(zhuǎn)染7天后制備大鼠MCAO/R模型，MCAO后30min給予VNS干預(yù)。實(shí)驗(yàn)操作過程中監(jiān)測大鼠的生理參數(shù)（心率、血壓及血?dú)猓┮约坝覀?cè)大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA）供血區(qū)腦組織血流量變化。再灌注24h時(shí)，利用Western blot和熒光定量PCR檢測各組大鼠缺血半暗帶區(qū)L-PGDS的表達(dá)。再灌注24h后對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分并測定腦梗死體積。采用TUNEL染色檢測大鼠缺血側(cè)

6、皮層神經(jīng)元凋亡的數(shù)量。Western Blot檢測凋亡通路分子（Bcl-2、Bax及cleaved caspase-3）的表達(dá)變化。免疫共沉淀檢測L-PGDS和PPARγ的相互作用。采用熒光定量PCR和Western blot檢測各組大鼠缺血半暗帶區(qū)PPARγ的表達(dá)。
　　第二部分：構(gòu)建慢病毒shRNA-L-PGDS沉默L-PGDS表達(dá)，慢病毒轉(zhuǎn)染后7天制備大鼠MCAO/R模型，MCAO后30min給予VNS干預(yù)。再灌注24h時(shí)，

7、檢測各組大鼠腦組織中伊文思藍(lán)滲出量和腦組織水含量。采用Western blot檢測緊密連接蛋白o(hù)ccludin，MMP-9及AQP4的表達(dá)。采用ELISA檢測缺血半暗帶區(qū)腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factorα，TNF-α）和白介素-6（Interleukin6，IL-6）的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　(1)腦I/R損傷誘導(dǎo)了大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)L-PGDS的表達(dá)增加（P＜0.05），這種

8、增加的趨勢一直持續(xù)到再灌注后3d，在再灌注24h時(shí)達(dá)到峰值。在缺血半暗帶區(qū)皮質(zhì)中，L-PGDS與NeuN和APC存在共表達(dá)，與GFAP無共表達(dá)。
　　(2)構(gòu)建的慢病毒載體可有效轉(zhuǎn)染到大鼠腦組織中。與正常組和空病毒組相比，慢病毒shRNA-L-PGDS明顯抑制了L-PGDS mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。
　　(3)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程中，VNS干預(yù)對(duì)大鼠的生理參數(shù)（包括平均心率、血壓和血?dú)庵笜?biāo)）以及右側(cè)MCA供血區(qū)腦血流量

9、改變無明顯影響（P＞0.05）。
　　(4)再灌注24h時(shí)，與缺血再灌注組（I/R）相比，VNS干預(yù)可進(jìn)一步增強(qiáng)腦I/R誘導(dǎo)的L-PGDS蛋白和mRNA表達(dá)水平增加（P＜0.05）；慢病毒載體介導(dǎo)的L-PGDS shRNA可有效抑制腦 I/R損傷誘導(dǎo)的L-PGDS蛋白和mRNA表達(dá)水平增加（P＜0.05），并減弱了VNS的增強(qiáng)效應(yīng)（P＜0.05）。
　　(5)再灌注24h時(shí)，VNS可改善腦I/R損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙并減少腦

10、梗死體積（P＜0.05）；沉默L-PGDS后，進(jìn)一步加重腦I/R損傷導(dǎo)致的腦組織損傷并削弱了VNS神經(jīng)保護(hù)作用（P＜0.05），提示L-PGDS可能參與了 VNS對(duì)缺血性卒中的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　(6)與I/R組相比，VNS可明顯減少大鼠缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量（P＜0.05）；沉默L-PGDS后，加重了腦I/R損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，并抑制了VNS的抗凋亡效應(yīng)（P＜0.05）。
　　(7)與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠缺血側(cè)

11、皮層中凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。與I/R組相比，VNS干預(yù)后Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)明顯減少（P＜0.05），Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；沉默L-PGDS表達(dá)后大鼠缺血側(cè)皮層Bax和 cleaved caspase-3的表達(dá)進(jìn)一步增加（P＜0.05），蛋白Bcl-2的表達(dá)進(jìn)一步降低（P＜0

12、.05），并明顯削弱VNS的抗凋亡作用（P＜0.05），提示L-PGDS可能介導(dǎo)了VNS對(duì)缺血性卒中的抗凋亡效應(yīng)。
　　(8)免疫共沉淀檢測證實(shí)L-PGDS與PPARγ之間存在相互作用。
　　(9)與假手術(shù)組相比，腦I/R損傷誘導(dǎo)了缺血半暗帶區(qū)PPARγ蛋白和mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）。與I/R組相比，VNS干預(yù)可進(jìn)一步增強(qiáng)PPARγ蛋白和mRNA表達(dá)；沉默L-PGDS表達(dá)后缺血半暗帶區(qū)PPARγ蛋白和mRNA表達(dá)水平

13、明顯下降（P＜0.05），并減弱了VNS的增強(qiáng)效應(yīng)（P＜0.05）。
　　第二部分：
　　(1)再灌注24h時(shí)，與假手術(shù)組相比，腦I/R損傷誘導(dǎo)了缺血側(cè)腦組織伊文思藍(lán)滲出量顯著增多，腦組織水含量明顯增加（P＜0.05）。與I/R組相比，VNS減少了伊文思藍(lán)的滲出量和腦組織的水含量（P＜0.05）；沉默L-PGDS后，加重了腦I/R損傷誘導(dǎo)的伊文思藍(lán)滲出和腦組織水含量增加（P＜0.05），并削弱了VNS對(duì)I/R損傷血腦屏障破壞

14、的改善作用（P＜0.05），提示L-PGDS可能參與了VNS對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用。
　　(2)與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠缺血半暗帶區(qū)AQP4和 MMP-9的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），occludin的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。與I/R組相比，VNS干預(yù)可減少AQP4和MMP-9的表達(dá)（P＜0.05），增加occludin的表達(dá)（P＜0.05）；沉默L-PGDS后，進(jìn)一步增加了腦I/R損傷誘導(dǎo)的AQP4和MMP-9的表達(dá)（

15、P＜0.05），進(jìn)一步降低了occludin的表達(dá)（P＜0.05），并減弱了VNS對(duì)血腦屏障的改善作用（P＜0.05），提示L-PGDS可能介導(dǎo)了VNS對(duì)腦I/R后血腦屏障的保護(hù)作用。
　　(3)VNS可減輕急性腦I/R損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制缺血側(cè)皮質(zhì)中炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)（P＜0.05）；沉默L-PGDS后，VNS的抗炎效果明顯下降，炎癥因子的表達(dá)增加（P＜0.05），提示L-PGDS參與了VNS對(duì)缺血性腦卒

16、中后炎癥反應(yīng)的抑制。
　　結(jié)論：
　　(1) VNS可減少急性腦缺血再灌注大鼠的腦梗死體積，改善大鼠的神經(jīng)功能缺失。
　　(2) VNS干預(yù)減少急性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡的數(shù)量，抑制凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，減輕了腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。
　　(3) VNS干預(yù)減少急性腦缺血再灌注后緊密連接蛋白o(hù)ccludin的降解，降低MM