嗜熱厭氧乙醇桿菌木糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝系統(tǒng)的分子重組研究.pdf

1、生物乙醇作為一種清潔的可再生能源被多數(shù)國家納入發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃。廉價的原料是燃料乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的必要條件,利用可再生植物纖維資源制取乙醇成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。木糖是木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中含量僅次于葡萄糖的單糖,將木糖發(fā)酵生成乙醇,可提高纖維素轉(zhuǎn)化乙醇的效率,從而降低生產(chǎn)成本,促進(jìn)燃料乙醇生產(chǎn)工業(yè)化。迄今發(fā)現(xiàn)的微生物或構(gòu)建的工程菌株,木糖發(fā)酵乙醇的生產(chǎn)性能仍然不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求,因此,篩選性能優(yōu)良的木糖發(fā)酵菌株和研究微生物木糖代謝工程成為該

2、領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。
　　 本文主要研究內(nèi)容是從嗜熱厭氧乙醇桿菌(Thermoanaerobacter ethanolicusJW200)基因組DNA中克隆木糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)基因,并對相應(yīng)操縱子進(jìn)行序列分析；對木糖異構(gòu)酶進(jìn)行表達(dá)純化及酶學(xué)性質(zhì)的分析；利用Red重組方法將木糖轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝操縱子整合到大腸桿菌基因組,研究重組菌株利用木糖的能力。
　　 1.從嗜熱厭氧乙醇桿菌基因組中克隆了包括木糖轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子在內(nèi)的9個基因,通過序列分

3、析確定了木糖轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子包括xylF,xylG和xylH三個基因,并對木糖轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列進(jìn)行了分析。
　　 2.構(gòu)建了攜帶木糖轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子的整合質(zhì)粒,利用RED重組系統(tǒng),將嗜熱厭氧乙醇桿菌來源的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子整合到大腸桿菌基因組D型乳酸脫氫酶位點(diǎn),同時敲除D型乳酸脫氫酶基因,獲得了整合菌株E.coli K12(ΔDldh::xylFGH)；整合菌株E.coli K12(ΔDldh::xylFGH)能夠在以木糖為唯一碳源的M

4、9培養(yǎng)基中生長,而且生長趨勢比野生型菌株E.coli K12要好。
　　 3.從嗜熱厭氧乙醇桿菌基因組中克隆了木糖代謝操縱子(xylAB)以及上游基因xylAlike,其中xylAlike作為木糖代謝操縱子上游基因與其他嗜熱厭氧菌株有很大的差異性；并對木糖代謝操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列進(jìn)行了分析。
　　 4.在大腸桿菌中成功表達(dá)了木糖異構(gòu)酶(XylA),通過熱處理和陰離子交換柱兩步純化后,酶純度達(dá)到電泳均一。純化的XylA最適

5、反應(yīng)溫度為85℃,最適pH為7.0,在pH6～10之間有良較好的穩(wěn)定性,1 h半衰期溫度為85℃。當(dāng)XylA催化木糖時,Co2+、Mn2+和Mg2+對其活性有很大的激活作用:催化葡萄糖時,Co2+和Mg2+對其活性有很大的激活作用。以D-木糖為底物,XylA的米氏常數(shù)Km為11 mM,酶促最大反應(yīng)速率Vmax為25U／mg。
　　 5.構(gòu)建了攜帶木糖代謝操縱子的整合質(zhì)粒,利用Red重組系統(tǒng),以E.coliK12(ΔDldh::x