線粒體GTPase相關通路調控下高壓氧對脊髓損傷大鼠神經(jīng)保護的機制研究.pdf

1、目的：創(chuàng)傷性脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是由于外力作用造成脊髓神經(jīng)元的急性壞死，繼發(fā)性凋亡將進一步加重細胞損傷，臨床表現(xiàn)為運動、感覺等多功能障礙，嚴重影響患者生存質量。既往發(fā)現(xiàn)，SCI后氧化應激反應是Caspase凋亡通路激活的重要機制，也是高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）治療最初的理論依據(jù)。而在最新研究揭示，線粒體GTPase結構蛋白Drp1的表達變化要早于經(jīng)典凋亡通路的啟動。因此我們推

2、測，線粒體GTPase相關通路可能在HBO治療大鼠SCI中起到關鍵調控作用，但國內外未見報導。本研究擬通過神經(jīng)運動功能評定、脊髓組織切片及Western Blot蛋白檢測等手段，探討大鼠SCI后GTPase相關通路中Drp1、Fis1、Mfn1/Mfn2、Cyt C、Caspase-3等關鍵蛋白的變化規(guī)律及該通路調控下不同時間窗HBO治療對其神經(jīng)保護的調控機制，為SCI急性期的臨床救治提供新理論依據(jù)和技術選擇。
　　方法：

3、　　第一部分：將SD大鼠隨機歸入到陰性對照的Con組、僅椎板敲除的Sham組及脊髓打擊的SCI組，通過BBB下肢運動評分、運動誘發(fā)電位（MEP）及組織切片HE染色來評估SCI后神經(jīng)元運動功能恢復情況，通過TUNEL檢測大鼠SCI后神經(jīng)元凋亡數(shù)量，通過Western Blot檢測SCI后6h、12h、24h、48h、72h、7d、10d時損傷神經(jīng)組織中Drp1、Fis1、Mfn1/Mfn2蛋白含量的時態(tài)變化。
　　第二部分：在第一部

4、分基礎上，隨機將SD大鼠歸入Sham組、SCI組及高壓氧治療的HBO組，其中HBO組根據(jù)介入時間窗又分為HBO-24h組、HBO-48h組、HBO-72h組三個亞組。通過BBB評分及MEP檢測評估神經(jīng)運動功能恢復情況。在全部完成3d療程的HBO后取材，并通過組織切片HE染色及TUNEL檢測不同時間窗HBO對大鼠SCI后神經(jīng)修復的影響，通過Western Blot檢測不同時間窗HBO對大鼠SCI后損傷脊髓組織中Drp1、Fis1、Mfn1

5、/Mfn2及Cyt C、Caspase-3蛋白表達的影響。
　　結果：
　　第一部分
　　SCI組大鼠脊髓組織HE染色切片可見脊髓組織嚴重破壞，灰、白質分界模糊，白質松散不規(guī)則，損傷區(qū)出現(xiàn)壞死灶、微囊腔改變、尼氏體形成，BBB評分及 MEP波幅在損傷低峰后有一定程度的提高，TUNEL陽性細胞大量表達，與Con組及Sham組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Drp1、Fis1的表達在SCI后6h內明顯下降低于正常值，

6、12h后呈上升趨勢且高于正常值，48h達到峰值后開始下降，10d接近正常值,呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢；而Mfn1/Mfn2的表達在SCI后6h內上調高于正常值，12h后呈下降趨勢且低于正常值，48h達到低峰后再次上調，10d后與正常值接近，各組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　第二部分
　　SCI后第7d，HBO各亞組的BBB評分、MEP波幅及HE染色切片均可見神經(jīng)功能及細胞結構明顯改善。與SCI組相比，TUNEL陽性

7、細胞有不同程度減少，損傷的脊髓組織中Drp1、Fis1表達水平下調，Mfn1/Mfn2表達水平上調，Cyt C及Caspase-3表達水平下調，與SCI組相比均具有顯著差異（P＜0.05）。且以上變化在HBO-24h組更顯著，與HBO-48h組、HBO-72h組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：大鼠SCI后可見神經(jīng)運動功能下降、神經(jīng)元凋亡，且10天內均可見Drp1、Fis1及Mfn1/Mfn2表達量呈時相性變化。