腫瘤翻譯控制蛋白TCTP調(diào)控自噬在改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療敏感性中的作用研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在我國(guó)的發(fā)病率占原發(fā)腦腫瘤的31.1％，其中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM, Glioblastoma Mutiforme）惡性程度最高，大約占膠質(zhì)瘤的30%。GBM常呈侵襲性生長(zhǎng)，與正常腦組織界限不明確，手術(shù)效果不佳并具有放療抗性，盡管目前臨床GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是“手術(shù)+放療+替莫唑胺（TMZ， Temozolomide）輔助化療”，但整體預(yù)后不良，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)GBM患者的中位生存期僅為14.4個(gè)月。近

2、年來(lái)，放療技術(shù)發(fā)展迅速，但GBM放療抵抗依然是臨床治療中面臨的難題。研究表明，受照膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡主要通過(guò)自噬途徑發(fā)生而不是凋亡，因此，圍繞自噬開展針對(duì)GBM細(xì)胞的有效靶點(diǎn)及放療敏感性研究是當(dāng)今放射醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　腫瘤翻譯控制蛋白（TCTP,Translationally controlled tumor protein）是一種高度保守的親水性小分子蛋白，廣泛存在于真核組織細(xì)胞中，具有參與轉(zhuǎn)錄和翻譯、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抗凋亡

3、、促進(jìn)腫瘤形成和DNA損傷修復(fù)等多種重要功能，此外，TCTP的異常高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的臨床病理分級(jí)及預(yù)后密切相關(guān)。
　　盡管尚無(wú)直接證據(jù)表明TCTP參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的自噬，但已有研究證實(shí)，與TCTP直接相關(guān)的多個(gè)DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵蛋白、應(yīng)激反應(yīng)和抗凋亡分子通路均在自噬調(diào)控中發(fā)揮重要作用，例如，缺氧和糖尿病狀態(tài)下，TCTP可以通過(guò)AMPK通路或作為鳥苷酸轉(zhuǎn)化因子調(diào)控mTORC1活性，而mTORC1復(fù)合物是自噬起始階段最關(guān)鍵的復(fù)合物；從分

4、子結(jié)構(gòu)上分析，TCTP的N末端具有與Bcl-2家族蛋白BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的能力，而自噬起始階段關(guān)鍵蛋白Beclin1已被證實(shí)為一種新的BH3-only蛋白，因此，TCTP在結(jié)構(gòu)上既具有同Beclin1直接結(jié)合的可能，也具有影響B(tài)cl-xL和Beclin1結(jié)合的可能。
　　本研究旨在闡明TCTP在受照GBM細(xì)胞自噬發(fā)生中的作用及其對(duì)細(xì)胞放療敏感性的影響，通過(guò)圍繞TCTP-mTORC1和TCTP-Beclin1開展相關(guān)分子機(jī)制研究，為尋

5、找針對(duì)GBM細(xì)胞輻射抵抗的關(guān)鍵靶分子提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究采用AVO染色、自噬特異性染色、mRFP-GFP-LC3腺病毒感染、透射電鏡和蛋白質(zhì)印記（WB， Western blot）等方法對(duì)受照膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬流的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；采用藥物抑制或基因干擾的方法研究TCTP在受照GBM細(xì)胞自噬發(fā)生中的作用及相關(guān)分子機(jī)制；采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力；采用MTT、克隆形成和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)等綜合評(píng)估TCTP調(diào)控自噬對(duì)G

6、BM細(xì)胞輻射敏感性的影響。
　　研究主要發(fā)現(xiàn)：
　　1.受照GBM細(xì)胞的自噬發(fā)生規(guī)律：與正常對(duì)照組相比，2Gy分割照射（≥5次）可引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)p-mTORC1水平升高和自噬抑制；單次6Gy X射線輻照后1-3天，細(xì)胞內(nèi)TCTP蛋白表達(dá)顯著增多，照后4-7天，TCTP表達(dá)量逐漸降低，輻照后5到7天，Autophagy Assay Kit染色、mRFP-GFP-LC3腺病毒感染實(shí)驗(yàn)和透射電鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)的自噬體和自噬溶酶

7、體結(jié)構(gòu)顯著增多，Western Blot結(jié)果表明，自噬標(biāo)記蛋白Beclin1和LC3B的表達(dá)增加，提示受照膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬性死亡主要發(fā)生在輻照后5-7天。
　　2. TCTP在受照GBM細(xì)胞自噬激活中的作用：篩選出針對(duì)GBM細(xì)胞有效抑制TCTP表達(dá)的藥物：甲硫噠嗪和雙氫青蒿素。實(shí)驗(yàn)顯示，利用藥物抑制受照GBM細(xì)胞的TCTP表達(dá)，輻照后48h，自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B-II/I比例顯著升高、p62表達(dá)降低，熒光染色和透射電鏡結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)

8、細(xì)胞內(nèi)自噬發(fā)生；采用基因干擾技術(shù)（小干擾RNA或構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)低表達(dá)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系）抑制TCTP表達(dá)，結(jié)果與之一致，提示TCTP在受照膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生中發(fā)揮抑制作用。
　　3.TCTP參與調(diào)控Beclin1復(fù)合物功能和ATM-AMPK-mTOR信號(hào)通路：蛋白質(zhì)共沉淀（CoIP，Co-Immunoprecipitation）和熒光共定位實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，GBM細(xì)胞受到輻照后，TCTP與Beclin1的共定位表達(dá)顯著增強(qiáng)，同時(shí)，過(guò)表達(dá)TCTP可

9、抑制Beclin1與Vps34結(jié)合，相反，低表達(dá)TCTP可以促進(jìn)二者的結(jié)合；WB結(jié)果顯示，抑制TCTP表達(dá)，受照GBM細(xì)胞在輻照后48h即出現(xiàn)ATM-AMPK通路激活、mTOR抑制，從而激活自噬，提示TCTP可以通過(guò)ATM-AMPK通路調(diào)控自噬的發(fā)生。
　　4.激活自噬或抑制TCTP均可有效提高GBM細(xì)胞的輻射敏感性：使用雷帕霉素激活受照GBM細(xì)胞自噬發(fā)生，細(xì)胞的劃痕愈合能力明顯降低，MTT增殖曲線下移；穩(wěn)轉(zhuǎn)低表達(dá)TCTP的GBM

10、細(xì)胞受到輻照后，MTT實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞生存能力顯著降低，Transwell實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的遷移能力降低，雙氫青蒿素在抑制TCTP激活自噬的同時(shí)可抑制受照膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移。
　　5.在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制TCTP可提高GBM的放療敏感性：裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明，腹腔注射雙氫青蒿素可有效抑制腦腫瘤組織中的 TCTP表達(dá)、降低受照荷瘤小鼠的移植瘤質(zhì)量，同時(shí)伴隨自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B-II/I的比例顯著增加。
　　6. TCTP影響膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后

11、：通過(guò)檢索TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，分析GBM患者臨床和基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，TCTP基因TPT1突變（缺失性為主）可顯著延長(zhǎng)GBM患者的中位生存期和無(wú)病生存期，同時(shí)，TPT1突變腦組織中的TP53/PTEN蛋白平均表達(dá)水平增加，伴隨EGFR蛋白表達(dá)降低；接受標(biāo)準(zhǔn)放療患者中，TCTP mRNA高表達(dá)者中位生存期明顯縮短。
　　研究結(jié)論：
　　1.TCTP參與抑制受照GBM細(xì)胞的自噬發(fā)生。一方面，TCTP通過(guò)與Beclin1相互作用而影響B(tài)e

12、clin1-Vps34復(fù)合物功能，另一方面，輻照后48h，TCTP可抑制ATM-AMPK信號(hào)通路，進(jìn)而激活mTOR并抑制自噬發(fā)生。
　　2.離體條件下，激活自噬或通過(guò)抑制TCTP激活自噬，均可提高GBM細(xì)胞的輻射敏感性；
　　3.甲硫噠嗪和雙氫青蒿素可有效抑制GBM細(xì)胞TCTP的表達(dá)，其中，雙氫青蒿素可提高移植瘤裸鼠的放療敏感性并激活GBM細(xì)胞自噬，提示TCTP參與調(diào)控受照GBM細(xì)胞的自噬并影響其輻射敏感性。
　　4.