調(diào)節(jié)自噬表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞放療敏感性改變的作用及機(jī)制研究.pdf

1、肺癌細(xì)胞的生物學(xué)發(fā)生是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程。尋找有效的抗癌方法與途徑，在肺癌的發(fā)生階段可以修復(fù)細(xì)胞成分的早期改變，肺癌形成之后能夠清除突變或者損傷了的細(xì)胞器，甚至在肺癌形成后逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。 近年來(lái)的研究顯示：細(xì)胞器的代謝主要依靠自噬途徑。在生命的進(jìn)化過(guò)程中，自噬是一個(gè)古老的生物學(xué)現(xiàn)象，廣泛存在于植物和其它較低級(jí)生命體中，是生物降解胞內(nèi)蛋白，完成細(xì)胞器轉(zhuǎn)化，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要方式，也是哺乳動(dòng)物清除癌細(xì)胞的手段

2、之一。自噬是一個(gè)有大量小分子蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過(guò)程，人類自噬過(guò)程中比較明確的和研究較多的是Beclin1基因和其編碼蛋白。自噬體形成必需的微管相關(guān)蛋白輕鏈3（MAPLC3)也常常用于自噬體的檢測(cè)。 出于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的目的，正常情況下細(xì)胞自噬的基礎(chǔ)水平保持在一個(gè)較低的狀態(tài)，在某些“危機(jī)”狀況下可以快速上調(diào)，如：生長(zhǎng)激素缺乏、饑餓、細(xì)胞重建、細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)過(guò)多的受損細(xì)胞器或代謝廢物等。自噬受兩種進(jìn)化中形成的營(yíng)養(yǎng)感受器調(diào)節(jié)：TOR激

3、酶（target of rapamycin(TOR) kinase）在營(yíng)養(yǎng)充分時(shí)關(guān)閉自噬信號(hào)，真核起始因子2 激酶Gcn2（eukaryotic initiation factor 2(eIF2) kinase Gcn2）及其下游靶位Gcn4－自噬基因的轉(zhuǎn)錄反式作用子，在饑餓時(shí)啟動(dòng)自噬信號(hào)。TOR激酶的下游是一些編碼ATG蛋白的基因，參與自噬的發(fā)生，融合，成熟，再循環(huán)。雷帕霉素是TOR受體的拮抗劑，因此能夠上調(diào)自噬。另外較常用3甲基腺嘌

4、啉（3MA）抑制自噬。 自噬和癌細(xì)胞的形成、轉(zhuǎn)化、治療敏感性密切相關(guān)。癌細(xì)胞形成早期刺激自噬能夠清除受損細(xì)胞器，分解細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的有害物質(zhì)（如過(guò)氧化物等），阻止正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，調(diào)控自噬的表達(dá)和化療藥物聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有協(xié)同或拮抗作用，表現(xiàn)為與單純用化療藥物相比，調(diào)控自噬表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的凋亡率發(fā)生了變化。在化療或放療中抑制自噬有可能導(dǎo)致癌細(xì)胞無(wú)法清除受損細(xì)胞器，加速細(xì)胞死亡，強(qiáng)化治療效果。 為了研究自噬和非小細(xì)胞肺癌

5、的關(guān)系，以及調(diào)節(jié)自噬的表達(dá)可能產(chǎn)生的放療增敏效果，本研究檢測(cè)了經(jīng)手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）臨床標(biāo)本中的自噬相關(guān)基因表達(dá)狀態(tài)，探討自噬的表達(dá)情況和NSCLC發(fā)生和發(fā)展的可能關(guān)系；觀察了肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549在γ射線照射下自噬和自噬上游信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的改變；研究了改變肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中自噬表達(dá)后，A549細(xì)胞對(duì)于放射治療敏感性的變化以及自噬相關(guān)通道蛋白和一些耐藥基因改變，檢驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞周期和凋亡率，進(jìn)而對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討，探究自噬與凋亡

6、的內(nèi)在聯(lián)系和在程序性細(xì)胞死亡（PCD）的作用和意義。 本研究中，采集了2006年4月至2006年10月武漢協(xié)和醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌新鮮標(biāo)本72例，冰凍病理切片免疫熒光染色檢測(cè)肺癌組織，癌旁組織，正常組織中自噬特異性基因Beclin1和MAPLC3表達(dá)；提取總蛋白和總RNA，采用Westernblot和RT-PCR檢測(cè)Beclin1和MAPLC3蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄情況并且進(jìn)行半定量分析。培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，對(duì)

7、其采用γ射線照射，檢測(cè)在射線作用下自噬相關(guān)蛋白和mRNA以及上游akt和mTOR的表達(dá)。用3甲基腺嘌呤（3-methyladenine 3MA）和雷帕霉素（Rapamycin）改變其自噬的表達(dá)（3MA抑制自噬表達(dá)，Rapamycin則上調(diào)自噬表達(dá)），收集細(xì)胞后檢測(cè)不同自噬表達(dá)狀態(tài)下其抑制率和細(xì)胞凋亡率，以及細(xì)胞周期改變情況；細(xì)胞集落試驗(yàn)檢測(cè)不同自噬表達(dá)情況下射線對(duì)細(xì)胞增殖的抑制情況；Western blot檢測(cè)MAPLC3、pakt、m

8、TOR、COX2等蛋白表達(dá)，RTPCR檢測(cè)MAPLC3、survivin、mTOR、Bcl-2、EIF-4E的mRNA轉(zhuǎn)錄情況水平。Beclin1和MAPLC3免疫熒光染色流式細(xì)胞檢測(cè)A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)率，分析凋亡和自噬在PCD中的關(guān)系。 對(duì)NSCLC臨床切除標(biāo)本免疫熒光染色和蛋白mRNA檢測(cè)顯示，Beclin1和MAPLC3在肺癌組織中表達(dá)低于在癌旁組織和非癌組織，而癌旁組織和正常組織中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Γ射線能