SALL4對膠質(zhì)瘤細胞功能和化療敏感性的作用研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的惡性腫瘤，對于呈浸潤性生長的高級別膠質(zhì)瘤，手術(shù)基本無法達完全切除腫瘤的目的，膠質(zhì)瘤術(shù)后容易復(fù)發(fā)?；熕幬锏氖褂脤ρ娱L膠質(zhì)瘤患者的生存期有一定的作用，但高級別膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細胞瘤，容易發(fā)生對化療藥物多藥耐藥現(xiàn)象（MDR，multidrug resistance），繼而影響患者的治療效果。
　　SALL4是人SALL基因家族的一員，在維持胚胎干細胞自我更新和多向分化能力方面起重要作用，在腫瘤中

2、，SALL4對血液系統(tǒng)惡性腫瘤、生殖細胞腫瘤、及部分非生殖細胞來源的惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用，而在膠質(zhì)瘤中的作用尚不明確。在本課題中，我們將使用免疫組化染色及RT-PCR的方法，在54例腦膠質(zhì)瘤及7例正常腦組織中檢測SALL4蛋白及mRNA的表達水平，并通過門診和電話對腦膠質(zhì)瘤患者進行隨訪，明確SALL4蛋白表達水平與患者預(yù)后之間的關(guān)系。在體外實驗中，通過構(gòu)建慢病毒，在U251細胞株中干擾SALL4表達，檢測這種情況下膠質(zhì)瘤細胞增殖

3、、凋亡、細胞周期及侵襲能力方面的改變，從而明確SALL4的異常表達對膠質(zhì)瘤細胞功能的影響。然后，將細胞株同不同濃度替莫唑胺共培養(yǎng)，觀察在細胞株中敲減SALL4后膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物敏感性的變化情況。繼而在膠質(zhì)瘤U251細胞株中敲減SALL4后，使用RT-PCR及Western blot法在mRNA及蛋白水平上檢測胚胎干細胞核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、NANOG及化療耐藥基因ABCG2、MGMT的表達水平變化。從而對明確SALL4表達

4、與膠質(zhì)瘤細胞干細胞樣特性及化療耐藥基因之間的關(guān)系。
　　本文主要從以下幾方面進行了論述:
　　第一部分 SALL4在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及意義
　　目的：本部分研究目的即檢測SALL4在膠質(zhì)瘤中的表達，并明確其表達在診斷和判斷預(yù)后方面的作用。
　　方法：在54例膠質(zhì)瘤組織及7例正常腦組織中使用免疫組化染色及實時定量PCR的方法，在正常腦組織和膠質(zhì)瘤中檢測SALL4蛋白及mRNA的表達，對相關(guān)臨床病理資料進行統(tǒng)計分析

5、，并對膠質(zhì)瘤患者進行生存分析。
　　結(jié)果：免疫組化染色發(fā)現(xiàn)SALL4蛋白表達大多定位于細胞質(zhì)中，著色后呈棕黃色/棕褐色顆粒，正常腦組織中僅有少量SALL4蛋白表達。在高級別膠質(zhì)瘤中，SALL4陽性表達明顯高于低級別膠質(zhì)瘤（P=0.030），RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)SALL4 mRNA在正常腦組織相對表達量為1.00±0.52，低級別膠質(zhì)瘤中為1.93±0.81，而在高級別膠質(zhì)瘤中為2.42±0.58，各組間有顯著性差異（P<0.05）

6、。而免疫組化及RT-PCR檢測均發(fā)現(xiàn)SALL4表達與患者年齡，性別，術(shù)前KPS評分及腫瘤切除程度無明顯相關(guān)。ROC分析提示通過檢測SALL4 mRNA來區(qū)分膠質(zhì)瘤與正常腦組織的敏感性為92.59％，特異性為85.71%。Cox生存分析提示SALL4表達與患者預(yù)后明顯相關(guān)，SALL4表達水平較高患者預(yù)后較差。
　　結(jié)論：SALL4在膠質(zhì)瘤的生長和發(fā)展中起重要作用，檢測SALL4的表達有助于膠質(zhì)瘤的診斷，亦有助于判斷患者的預(yù)后。

7、>　　第二部分 慢病毒敲減SALL4后對膠質(zhì)瘤細胞株U251細胞功能及化療敏感性的影響
　　目的：明確SALL4表達水平變化對膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡、細胞周期、侵襲能力及化療敏感性的影響。
　　方法：構(gòu)建慢病毒，在U251細胞株中選擇對SALL4干擾效果較好的一組，CCK8法檢測細胞增殖，AV/PI染色測定細胞凋亡，流式細胞儀測定細胞周期改變，Transwell試驗檢測侵襲性改變。繼而將細胞株同不同濃度替莫唑胺共培養(yǎng)，觀察在細

8、胞株中敲減SALL4后膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物敏感性的變化情況。
　　結(jié)果：根據(jù)PCR和Western blot檢驗結(jié)果選擇72h Lentivirus-homo-SALL4-4組慢病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染U251細胞72小時后，測空白對照組OD值為1.98±2.30；Lenti-GFP組為2.10±0.21；檢測OD值在Lenti-shRNA組為1.52±0.11。Lenti-shRNA組細胞增殖能力明顯減弱（P<0.05）。細胞凋亡試驗結(jié)

9、果顯示，空白對照組早期凋亡細胞6.10±0.14%，Lenti-GFP組為29.95±0.86%，而Lenti-shRNA組為86.41±0.87%。和空白對照組及陰性對照組相比，敲減SALL4后，膠質(zhì)瘤U251細胞早期凋亡顯著增加（P<0.01）。空白對照組中細胞處于G0-G1期百分比為42.30±0.42%，處于S期百分比為36.69±0.36%，處于G2–M期百分比為21.02±0.25%；Lenti-GFP組中G0-G1期百分比

10、為52.11±1.92%，S期百分比為26.21±0.39%，G2-M期百分比為21.68±2.08%；Lenti-shRNA組G0-G1期百分比為78.93±2.49%，S期百分比為11.57±0.60%，G2-M期百分比為9.50±1.93%。Lenti-shRNA組中處于G0-G1期的細胞數(shù)量數(shù)量明顯高于其他兩組，而處于S期和G2–M期的細胞數(shù)量較其他兩組則顯著降低（P<0.05）。細胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn)空白對照組中侵襲細胞均數(shù)為：94

11、.33±3.51；Lenti-GFP組中為：91.33±1.53；Lenti-shRNA組為：47.33±3.21。Lenti-shRNA組中侵襲細胞均數(shù)較空白對照組和陰性對照組有顯著地下降（P<0.01），細胞侵襲能力明顯受到抑制。替莫唑胺IC50試驗發(fā)現(xiàn)空白對照組IC50值為113.67±23.07μg/ml，Lenti-GFP組為114.93±20.91μg/ml，Lenti-shRNA組為75.86±7.28μg/ml，敲減SA

12、LL4后，膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性明顯增強（P<0.05）。
　　結(jié)論：SALL4的表達水平對膠質(zhì)瘤細胞的細胞功能有重要影響，敲減SALL4可以提高膠質(zhì)瘤對化療藥物替莫唑胺的敏感性。
　　第三部分 敲減SALL4后膠質(zhì)瘤細胞株U251細胞功能及化療敏感性變化的機制探討
　　目的：明確SALL4表達與胚胎干細胞核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、NANOG及化療耐藥基因ABCG2、MGMT之間的關(guān)系。
　　方法：在

13、膠質(zhì)瘤U251細胞株中敲減SALL4后，使用RT-PCR及Western blot法檢測OCT4、SOX2、NANOG、ABCG2及MGMT的表達水平變化。
　　結(jié)果：敲減SALL4后，RT-PCR檢測U251細胞株中OCT4、SOX2、NANOG、ABCG2及MGMT的mRNA表達水平均顯著下降（P<0.05），Western blot檢測其蛋白表達水平改變與RT-PCR一致。
　　結(jié)論：SALL4的表達與膠質(zhì)瘤的干細胞樣