抑郁癥前額葉皮層GABA能神經(jīng)元功能失調(diào)分子機(jī)制研究.pdf

1、抑郁癥是一種危害人類身心健康常見、慢性易復(fù)發(fā)的情感性精神障礙。抑郁癥發(fā)作的典型癥狀包括：長(zhǎng)久的持續(xù)的情緒低落、精神萎靡、快感缺失、認(rèn)知功能障礙、睡眠紊亂、回避社交場(chǎng)合和社交活動(dòng)等，且常并發(fā)其它神經(jīng)性疾病和慢性生理疾病，比如焦慮、帕金森氏癥、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、心血管疾病等。抑郁癥產(chǎn)生原因比較復(fù)雜，社會(huì)學(xué)因素、生物學(xué)因素、心理學(xué)因素等都將不同程度的影響抑郁癥的發(fā)作、進(jìn)程、治療及預(yù)后。其發(fā)病的危險(xiǎn)因素主要有性別、年齡、種族

2、、婚姻、社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況和文化程度、遺傳、生活事件和應(yīng)激等。抑郁癥病因尚不明確，因此抑郁癥的發(fā)病機(jī)制也存在著多種病理生理假說(shuō)。但是目前主要圍繞單胺類遞質(zhì)分泌減少及其突觸傳遞效能減弱，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功能失調(diào)，應(yīng)激環(huán)境與遺傳因素相互作用，抑制和興奮性突觸傳遞和突觸可塑性異常，以及大腦皮層和邊緣系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能環(huán)路異常等理論探討抑郁癥的病因機(jī)制。針對(duì)復(fù)雜的致病機(jī)制，目前抑郁癥的治療方法主要包括：抗抑郁藥物：三環(huán)類抗抑郁藥，單胺氧化酶抑

3、制劑，選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑（SSRI），選擇性5-羥色胺及去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑；心理治療：目前采取心理治療常見的方式是認(rèn)知行為療法；電痙攣療法：患者全身麻醉的情況下，通過(guò)兩個(gè)電極（通常位于患者的兩顳）短期使電流脈沖穿過(guò)抑郁患者大腦，為此引發(fā)一次全身性的痙攣；快速抗抑郁藥物。MicroRNAs（miRNAs）是一類新近發(fā)現(xiàn)的約有22個(gè)核苷酸構(gòu)成的內(nèi)源性非編碼小RNA，常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。作為表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要部分，

4、最近研究表明，大量 miRNAs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同腦區(qū)特異性的表達(dá)或富集，而抑郁癥患者相關(guān)腦區(qū)的高級(jí)神經(jīng)功能出現(xiàn)紊亂，并且這種功能的失調(diào)隨后導(dǎo)致腦區(qū)中 miRNAs表達(dá)量發(fā)生變化。miRNAs可通過(guò)調(diào)控神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性及神經(jīng)影響因子等生理過(guò)程參與抑郁癥的病理生理學(xué)過(guò)程。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴經(jīng)過(guò)慢性不可預(yù)知溫和刺激（Chronic unpredicted wild stress, CUMS）處理小鼠三周后，行

5、為學(xué)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，抑郁樣行為組小鼠糖水偏好值，M臂中停留時(shí)間與總臂中停留時(shí)間的比率顯著降低（P＜0.05），而強(qiáng)迫游泳中不動(dòng)時(shí)間明顯增加。⑵小鼠前額葉mRNA高通量測(cè)序結(jié)果表明：CUMS誘導(dǎo)的抑郁樣行為中40 mRNA顯著下調(diào)（Slc6a11、Hap1、Gad1、Gad2、Gng4、Slc32a1、Doc2g、Slc32a1、Magel2、Prkcd、Ngfr、Dusp1、Th、Itih3、Cacna2d2、Arc、Mbp、Pe

6、g10、Fos等），10個(gè)mRNA顯著上調(diào)。⑶差異表達(dá)基因信號(hào)通路富集分析顯示 GABA能通路，多巴胺能，突觸小泡循環(huán)，安非他明/嗎啡成癮，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)，MAPK信號(hào)及趨化因子-細(xì)胞因子受體信號(hào)傳導(dǎo)等參與了慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁病理生理學(xué)過(guò)程。⑷小RNA高通量測(cè)序分析表明，18個(gè)miRNA（miR-148b-5p、miR-879-5p、miR-144-3p、miR-540-5p、miR-582-5p、miR-15b-5p等）在抑郁樣行為

7、組表達(dá)量顯著升高。4個(gè)顯著降低的miRNA是miR-384-5p、miR-1264-3p、miR-217-5p、miR-490-5p。此外檢測(cè)到7個(gè)新型 miRNA（novel_mir_46、novel_mir_214、novel_mir_213、novel_mir_10、novel_mir_39、novel_mir_128、novel_mir_54）。其中 novel_mir_46的表達(dá)量在抑郁樣行為組中明顯高于對(duì)照組，novel_m

8、ir_214和novel_mir_213僅在抑郁樣行為組中表達(dá)，而novel_mir_10、novel_mir_39、novel_mir_128及novel_mir_54僅在對(duì)照組中表達(dá)。⑸通過(guò)三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)（Targetscan、RNA22和 miRDB）對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，選擇同被2個(gè)以上（包括兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)）數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的靶基因，進(jìn)一步與已經(jīng)構(gòu)建的差異基因進(jìn)行重疊，繪制了抑郁樣行為小鼠前額葉 miRNA/mRNA

9、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。⑹為了進(jìn)一步驗(yàn)證RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，我們選擇了5個(gè)mRNA，其中包括兩個(gè)顯著升高的mRNA（Hbb-b1和Nr1d1），3個(gè)顯著下降的mRNA（Gad1、Mbp和Slc6a11）及4個(gè)上升的 miRNA（miR-879-5p、miR-582-5p、miR-144-3p、miR-15b-5p）在對(duì)照（n=8）和抑郁樣行為小鼠（n=8）前額葉進(jìn)行qRT-PCR定量分析。這些差異表達(dá)的基因或miRNA的qRT-PCR定量結(jié)果與

10、RNA測(cè)序分析得到一致結(jié)果（P值均小于0.05），進(jìn)一步證實(shí)了測(cè)序數(shù)據(jù)。⑺通過(guò)定量 GABA合成（GAD67）、轉(zhuǎn)運(yùn)（VGAT）和重?cái)z?。℅AT-3）蛋白發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（n=8）相比，抑郁樣行為組小鼠（n=8）前額葉組織中GAD-67，VGAT和GAT-3蛋白表水平顯著降低。⑻高通量測(cè)序定量GABA合成（GAD67）、轉(zhuǎn)運(yùn)（VGAT）和重?cái)z?。℅AT-3）mRNA的表達(dá)水平，CUMS誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠（n=2）前額葉皮層中GAD1，VGA

11、T和GAT-3顯著低于對(duì)照小鼠（n=2）。采用qRT-PCR擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證這些miRNAs表達(dá)量。相比于對(duì)照組（n=8）來(lái)自CUMS誘導(dǎo)的抑郁癥小鼠（n=8）的前額皮質(zhì)中的GAD-67，VGAT和GAT-3的基因表達(dá)水平顯著降低。⑼生物信息學(xué)分析表明GAD673'UTR兩個(gè)區(qū)域（769-775、902-908），VGAT3'UTR的一個(gè)區(qū)域（622-628）和GAT-33'UTR的兩個(gè)區(qū)域（272-278、1393-1399）與mi

12、RNA-144-3p結(jié)合。miRNA-15b-5p預(yù)測(cè)結(jié)合GAT-33'UTR的1740-1747區(qū)域。VGAT3'UTR的一個(gè)區(qū)域（608-614）是miRNA-582-5p的結(jié)合部位。miRNA-879-5p預(yù)測(cè)結(jié)合GAT-33'UTR的486-492。⑽qRT-PCR結(jié)果表明與GABA合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和重?cái)z取相關(guān)的miR-15b-5p、miRNA-879-5p、miRNA-144-3p和miRNA-582-5p在抑郁前額葉皮層組織中表達(dá)

13、量顯著增加。⑾qRT-PCR定量結(jié)果表明GABA合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和重吸收相關(guān)的mRNA和miRNA之間存在負(fù)性相關(guān)。⑿體外雙熒光素酶報(bào)告顯示miR-15b-5p和miRNA-879-5p直接負(fù)調(diào)控GTA-3，VGAT被miRNA-144-3p和miRNA-582-5p負(fù)調(diào)控，GAD1被miRNA-144-3p直接負(fù)調(diào)控。
　　本研究表明GABA合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和重?cái)z取的功能障礙與慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁癥相關(guān)。應(yīng)激誘導(dǎo)的GABA能神經(jīng)元的亞細(xì)胞區(qū)室

14、之間的不相容以及GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元之間的不協(xié)調(diào)導(dǎo)致在內(nèi)側(cè)前額皮質(zhì)中的不平衡的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，其可能是抑郁癥發(fā)作的病理基礎(chǔ)。同時(shí)支持了慢性應(yīng)激，表觀遺傳，基因/蛋白質(zhì)表達(dá)，神經(jīng)元萎縮導(dǎo)致抑郁癥發(fā)病假說(shuō)。未來(lái)的研究，我們需要將關(guān)于 GABA能神經(jīng)元紊亂的miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在機(jī)體層面作因果關(guān)系的研究。需要解決以下問(wèn)題：miRNA表達(dá)量的變化能否調(diào)控機(jī)體的抑郁樣行為學(xué)表型；改變miRNA的表達(dá)量能否通過(guò)改變靶基因表達(dá)或者活性，