脂質(zhì)自噬在BPA所致肝臟脂質(zhì)沉積中的作用研究.pdf

1、目的：環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A（Bisphenol A，BPA）可促進(jìn)肝臟脂質(zhì)沉積，但其機(jī)制尚不清楚。而脂質(zhì)自噬減弱可導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積的發(fā)生，其是否介導(dǎo)BPA所致的肝臟脂質(zhì)沉積，目前尚不清楚，本研究通過(guò)體內(nèi)外模型揭示脂質(zhì)自噬在BPA所致肝臟脂質(zhì)沉積中的作用。
　　方法：在體外實(shí)驗(yàn)中，將HepG2細(xì)胞分為對(duì)照組、BPA不同濃度（1、0.001、1、4、10μM）干預(yù)組、陽(yáng)性對(duì)照組即200μM油酸（Oleic acid，OA）聯(lián)合400

2、μM軟脂酸（Palmitic acid，PA）。分別給予上述不同干預(yù)24h。采用化學(xué)酶促-比色法定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（Triglyceride，TG）含量，油紅O及Bodipy493/503熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴，以明確體外脂質(zhì)沉積模型構(gòu)建是否成功。Real-time PCR及Western blot、免疫熒光等方法檢測(cè)在不同干預(yù)情況下HepG2細(xì)胞內(nèi)與自噬相關(guān)的指標(biāo)LC3、P62的表達(dá)水平，透射電鏡觀察自噬體數(shù)量，并對(duì)自噬的各個(gè)階段

3、進(jìn)行分析：①自噬的啟動(dòng)階段：Western blot等方法檢測(cè)p-mTOR、p-ULK1、Atg5表達(dá)水平；②自噬體與溶酶體融合階段：免疫熒光檢測(cè)LC3與LAMP1共定位；③溶酶體降解階段：AO染色檢測(cè)溶酶體酸度、Calthepsin L表達(dá)水平。進(jìn)一步用10μM BPA干預(yù)原代肝細(xì)胞，對(duì)上述部分關(guān)鍵結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，分別用不同濃度BPA（5、50、500μg/kg/day）喂養(yǎng)CD1小鼠42天后，檢測(cè)肝臟脂質(zhì)沉積，從體內(nèi)驗(yàn)證

4、脂質(zhì)沉積模型是否成功建立，并進(jìn)一步對(duì)自噬相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，從體內(nèi)對(duì)體外相關(guān)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：體外HepG2肝細(xì)胞及原代肝細(xì)胞中：1、不同濃度干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)TG含量不同程度增加，其中10μM BPA組升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。油紅O染色及Bodipy493/503脂滴染色結(jié)果與TG結(jié)果一致。2、Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10μM BPA干預(yù)后 LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯增加，同時(shí)與自噬降解

5、關(guān)系密切的蛋白 P62表達(dá)亦增加，加用抑制劑CQ阻斷自噬體降解后，BPA組LC3-Ⅱ的表達(dá)較單用CQ組降低，自噬通量受損。透射電鏡觀察到10μM BPA組自噬體數(shù)量堆積。3、對(duì)自噬過(guò)程的各個(gè)階段進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)：a、啟動(dòng)階段：10μM BPA干預(yù)后p-ULK1、p-mTOR表達(dá)增加，Atg5表達(dá)減少（p<0.05）；b、融合階段：10μM BPA干預(yù)后LC3與LAMP1融合減少；c、溶酶體降解階段：與對(duì)照組相比，10μM BPA干預(yù)組AO

6、染色熒光小點(diǎn)明顯減少，溶酶體酸度明顯減弱；Cathepesin L蛋白表達(dá)減少（p<0.05）。體內(nèi)試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，50、500μg/kg/day BPA干預(yù)組 CD1小鼠肝臟中 TG含量明顯增加（p<0.05），油紅O染色結(jié)果與TG結(jié)果一致；與對(duì)照組相比，BPA500組LC3-Ⅱ表達(dá)、P62表達(dá)明顯增加，Cathepesin L蛋白表達(dá)減少（p<0.05）。
　　結(jié)論：在體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)BPA可導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積，