Il-17F對(duì)大鼠成骨細(xì)胞BMp-2及Noggin mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：骨細(xì)胞和免疫細(xì)胞共同起源于骨髓細(xì)胞，它們?cè)诠δ苌弦灿幸欢ǖ南噙B，并且受一些相同細(xì)胞因子的影響。最近有研究顯示IL-17因子家族中的一個(gè)重要成員IL-17F在體內(nèi)具有促進(jìn)成骨細(xì)胞的作用，但是相關(guān)研究甚少。本研究通過(guò)提取并培養(yǎng)大鼠原代成骨細(xì)胞，以不同濃度的IL-17F刺激成骨細(xì)胞，觀察IL-17F對(duì)成骨細(xì)胞的增殖能力、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone Morphogenetic Protein2，BMP-2)及BMP-2抑制因子Noggin

2、 mRNA表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.大鼠原代成骨細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及鑒定
　　新生24h內(nèi)的Wistar大鼠8只，脫頸處死后，于無(wú)菌操作下取出顱骨，完全去除骨膜、血管及結(jié)締組織，反復(fù)沖洗骨片至透亮，將骨片剪碎后，運(yùn)用胰酶-膠原酶消化法及組織塊法提取原代成骨細(xì)胞。
　　將提取的原代成骨細(xì)胞加適量培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，并在傳代時(shí)運(yùn)用差速貼壁法對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行純化，取純化后的第4代成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　

3、采用形態(tài)學(xué)觀察及堿性磷酸酶(ALP)染色法對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組及IL-17F刺激
　　將純化后的第4代大鼠成骨細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組使用正常培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)組分別用正常培養(yǎng)液配制的含有不同濃度（1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）IL-17F的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，共5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別于干預(yù)第1、3、5天后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。
　　3.指標(biāo)檢測(cè)

4、　　(1)采用MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖活性。
　　(2)采用RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞BMP-2及Noggin mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定:
　　培養(yǎng)的原代成骨細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)穩(wěn)定，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況均符合成骨細(xì)胞的特征。ALP染色結(jié)果顯示，大量陽(yáng)性細(xì)胞胞核及胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)ALP染色成的灰黑色顆?；驂K狀深染沉淀，鑒定為成骨細(xì)胞。
　　2.IL-17F對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響
　

5、　MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，第1天時(shí)只有100ng/ml實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率明顯升高(P＜0.05），10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml實(shí)驗(yàn)組雖然也有升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);第3天與第5天時(shí)，10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率均顯著升高（P＜0.05）;1ng/ml實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)變化均不明顯(P＞0.05)。
　　3.IL-17F對(duì)成骨細(xì)胞BMP-

6、2及Noggin mRNA表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml實(shí)驗(yàn)組BMP-2 mRNA表達(dá)水平從第1天開(kāi)始就明顯升高(P＜0.05)，而10ng/ml實(shí)驗(yàn)組BMP-2 mRNA表達(dá)水平第3天開(kāi)始才顯著升高(P＜0.05)，1ng/ml實(shí)驗(yàn)組BMP-2 mRNA表達(dá)水平則在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯變化(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，10ng/ml、20ng/ml、50ng/