前列腺干細胞抗原(PSCA)對前列腺癌細胞周期的調(diào)控及其機制研究.pdf

1、【研究背景】
　　前列腺干細胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）基因編碼一個由123個氨基酸組成的糖蛋白，與SCA-2一樣，均屬于細胞表面葡萄糖磷酯酰肌醇（glycosyl phosphatidylinositol,GPI）錨定抗原（Thy-1/Ly-6基因）家族成員。目前相關(guān)研究表明PSCA具有很高的前列腺癌組織特異性，并且在局部進展性前列腺癌組織以及前列腺癌骨轉(zhuǎn)移灶中高表達，提示PSCA可能

2、在前列腺癌進展中起重要作用。然而，其具體生物學(xué)機制仍不清楚。
　　【目的】
　　研究PSCA在前列腺癌細胞增殖中的作用，并初步探討其對周期凋亡的調(diào)控機制。
　　【材料和方法】
　　前期已成功構(gòu)建的穩(wěn)定沉默PSCA的DU145細胞株及穩(wěn)定過表達PSCA的LNCAP細胞株。30只小鼠隨機分為6組，每組5只：DU145，DU145-NC(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的DU145細胞），DU145 shRNA（穩(wěn)定沉默PSCA的DU

3、145細胞）、LNCAP，LNCAP- vector（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的的LNCAP細胞），LNCAP PSCA（穩(wěn)定過表達PSCA的LNCAP細胞）。通過MTS、平板克隆形成實驗等體外功能實驗以及動物移植瘤實驗研究PSCA對前列腺癌細胞增殖的影響；通過流式細胞術(shù)了解細胞周期凋亡的變化，PCR、Weston blot等實驗檢測細胞周期凋亡相關(guān)基因表達；免疫組化染色研究組織PSCA以及c-myc等周期相關(guān)基因的表達；使用c-myc-siRN

4、A對過表達PSCA的LNCAP進行轉(zhuǎn)染，進一步研究PCSA對c-myc的調(diào)控作用；收集2013年12月前在我院前列腺癌初治病例。該研究納入的所有病例均行前列腺穿刺活檢或手術(shù)后的病理檢查確診為前列腺腺癌，并且相關(guān)檢查未見遠處轉(zhuǎn)移；納入患者的病理組織收集前均未接受化學(xué)治療或者放療；病例資料中如缺失隨訪資料、術(shù)前PSA值、Gleason評分、手術(shù)切緣情況或淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等描述均予以排除。通過病歷查找、電話隨訪對患者年齡、血清PSA、Gleas

5、on評分、腫瘤臨床分級、生化復(fù)發(fā)、總體生存等資料進行采集。
　　【結(jié)果】
　　MTS結(jié)果顯示：與對照組相比，72小時后，DU145-shRNA細胞增殖能力明顯較對照組減弱(P=0.000)；而過表達PSCA的LNCAP細胞增殖能力在48小時后明顯較對照組增強(P=0.000)。平板克隆實驗：DU145細胞在平板實驗中第7天便有較多的肉眼可見的克隆，于第七天終止實驗，進行后續(xù)的染色；而LNCAP細胞則需到14天才出現(xiàn)較多的肉眼

6、可見的克隆，于第14天終止實驗，進行后續(xù)的染色。結(jié)果顯示，在沉默PSCA的表達后，DU145 shRNA與對照組相比，形成的克隆更少、更小(P=0.000)；同樣的，過表達PSCA后的LNCAP與對照組相比，LNCAP PSCA的克隆數(shù)目明顯增多(P=0.000)。動物體內(nèi)移植瘤實驗結(jié)果：與體外細胞功能實驗結(jié)果相一致，PSCA明顯加速了移植瘤在裸鼠體內(nèi)的生長速度：DU145shRNA組在接種第19天后移植瘤體積開始明顯小于對照組（P=0

7、.000）；過表達PSCA后，LNCAP-PSCA組在接種2周后體積明顯比對照組增大；4周后對移植瘤進行解剖稱重，肉眼所見，DU145 shRNA與LCAP-vector移植瘤大體觀上較對照組??；DU145 shRNA瘤重明顯較對照組減小，而LNCAP-PSCA瘤重明顯較對照組增加(P=0.0000)。流式細胞術(shù)：，在正常DU145組G0/G1期細胞(48.56％±2.0%)明顯增加至DU145shRNA組（60.32%±1.2%,P=

8、0.000),DU145 NC組G0/G1期細胞為49.47%±2.5%，與正常組比較差異（P=0.492）；DU145-shRNA組凋亡率4.87%±0.48%，DU145-NC組凋亡率4.70%±0.61%，DU145組凋亡率4.23%±0.53%，經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.494）;LNCAP-PSCA組凋亡率1.89%±0.37%，LNCAP-vector組凋亡率2.26%±0.13%，LNCAP正常組凋亡率2.56%±0

9、.18%，經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.124）。qRT-PCR以及weston blot結(jié)果顯示：與DU145-NC組比較，DU145shRNA組無論在mRNA水平或者蛋白水平，c-myc、cyclin D1、cyclin E2表達下調(diào)P=0.000)；與之相反，在過表PSCA的LNCAP組中c-myc、cyclin D1、cyclin E2表達上調(diào)(P=0.000)。與周期抑制相關(guān)的基因P16、P27、凋亡相關(guān)蛋白caspase3

10、并沒有明顯差異。免疫組織化學(xué)法染色顯示，動物移植瘤組織DU145siRNA組組織表達PSCA、c-myc、cyclin D1、cyclin E2下調(diào)；LNCAP-PSCA組表達PSCA、c-myc、cyclin D1、cyclin E2上調(diào)，細胞PCR、western blot結(jié)果相符。對LNCAP-PSCA轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒si-c-myc后，c-myc、cyclin D1、cyclin E2表達下降（P=0.00），MTS實驗顯示si-c

11、myc+PSCA組生長曲較對照組線明顯減慢(P=0.000）。進一步對調(diào)控c-myc上游通路檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，P-AKT在DU145 shRNA蛋白水平明顯降低(P=0.000)，而在LNCAP-PSCA中明顯提高(P=0.000)。p-ERK1/2在DU145siRNA(p=0.886)以及LNCAP-PSCA（P=0.439）無明顯變化。使用AKT抑制劑MK2206后，c-myc以及其下游cyclin D1、cyclin E2

12、表達明顯下調(diào)(P=0.000)。MTS實驗MK2206明顯減緩過表達PSCA的LNCAP的生長曲線。通過查找病歷、電話訪問等收集到資料完整的前列腺癌病例78例，入院時間在2008年2月到2013年12月之間，結(jié)果顯示，高表達PSCA與高表達c-myc相關(guān)（P=0.014）；高表達PSCA和高表達c-myc都分別與gleason評分、BCR以及OS相關(guān)（P＜0.05），與年齡、血清PSA水平不相關(guān)（P＞0.05）；Kaplan–Meier

13、生存曲線顯示高表達PSCA與高表達c-myc與前列腺癌預(yù)后不良相關(guān)（P＜0.05）；通過cox多因素回歸分析表明PSCA和c-myc可作為獨立預(yù)測前列腺癌生化復(fù)發(fā)（分別為：HR2.834,95%CI1.124-7.141,P=0.027 and HR3.232,95%CI1.366-7.649,P=0.008）以及總體生存率（分別為HR10.559,95% CI1.295-86.129,P=0.028 and HR12.703,95%

14、CI1.611-100.183,P=0.016,respectively)的危險因素。
　　【結(jié)論】
　　PSCA通過激活PI3K/AKT通路上調(diào)c-myc以及其下游cyclin D1、cyclin E2基因的表達，促進細胞周期由G0/G1期進入S期，從而促進前列腺癌細胞的增殖；而PSCA沉默可誘導(dǎo)細胞周期G0/G1期阻滯。臨床上高表達PSCA與高表達c-myc相關(guān)，并且與前列腺癌患者更高的生化復(fù)發(fā)率以及更短的照片那個題生存