糖代謝在前列腺癌細(xì)胞干性調(diào)控作用中的研究.pdf

1、癌癥是全球范圍內(nèi)非常重要的公共健康問題。長期以來，前列腺癌被認(rèn)為是歐美國家男性中最常見的惡性腫瘤，然而，在我國，隨著人們平均壽命的延長、人口的老齡化的加劇，前列腺癌的發(fā)病率也逐漸增高，因此有效地防治前列腺癌是我國亟待解決的一個公共衛(wèi)生難題。在現(xiàn)階段，前列腺癌的治療方法主要有手術(shù)切除、雄激素去勢治療、放療、化療；但是，這些手段通常僅在起始階段有效，最終多數(shù)患者對這些傳統(tǒng)的治療都產(chǎn)生抵抗，發(fā)展為廣泛轉(zhuǎn)移。多年來，針對前列腺癌的基礎(chǔ)研究并沒有

2、為治療和預(yù)后帶來突破性的進(jìn)展，需要從新的角度尋找特異性的治療藥物和方法，這有賴于從不同的角度了解和掌握前列腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。
　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個動態(tài)而復(fù)雜的過程，目前研究者普遍認(rèn)為：惡性腫瘤中含有的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞是維持腫瘤生長的主要因素。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織內(nèi)含有的一小部分腫瘤細(xì)胞，其特性與干細(xì)胞類似，表現(xiàn)出能夠自我復(fù)制和更新的能力，可以進(jìn)行一定程度的分化。自1990s年加拿大的腫瘤研究者Dick在白血病中鑒定出腫瘤干細(xì)

3、胞之后，不斷有研究者通過各種手段在包括腦、乳腺、結(jié)腸、前列腺、胰腺等不同來源的腫瘤中檢測出腫瘤干細(xì)胞的存在，日益增多的證據(jù)表明：腫瘤干細(xì)胞極有可能是癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源，如何有效地和特異性地殺滅腫瘤干細(xì)胞是當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。因而，充分了解腫瘤干細(xì)胞的性質(zhì)、特征，從而通過靶向維持腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控途徑，達(dá)到有效殺滅腫瘤干細(xì)胞最終根治癌癥的目的。
　　近年的研究發(fā)現(xiàn)，正常干細(xì)胞特性的維持不但包括了表觀遺傳層次的修飾，同時也需要

4、細(xì)胞內(nèi)代謝模式轉(zhuǎn)化的協(xié)同參與。但是對于腫瘤干細(xì)胞代謝特征，現(xiàn)階段我們了解得遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。對正常干細(xì)胞能量代謝模式中的研究可以為我們提供思路，研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞，造血干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞以及誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPS）在不同的生理狀態(tài)下，有不同的代謝模式，體現(xiàn)在：這些干細(xì)胞中的線粒體氧化磷酸化水平低下，細(xì)胞更多地依賴糖酵解途徑進(jìn)行生存。這種代謝模式目前被認(rèn)為是維持細(xì)胞干性特征的必要因素；相反，當(dāng)這些干細(xì)胞的代謝模式從糖酵解為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐匝趸姿峄?/p>

5、為主時，通常認(rèn)為是干細(xì)胞起始分化的標(biāo)志。這個理論目前可以很好地在各種干細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證，同時iPS的誘導(dǎo)過程可以為我們在腫瘤干細(xì)胞研究中帶來更深的啟發(fā)。
　　我們知道，iPS細(xì)胞的本質(zhì)是對已分化的成體細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，以期恢復(fù)細(xì)胞分化的全能性。研究發(fā)現(xiàn)，這些終末分化細(xì)胞的代謝方式主要是線粒體介導(dǎo)的氧化磷酸化；然而當(dāng)在這些終末分化的細(xì)胞中導(dǎo)入干細(xì)胞四因子（Sox2、c-Myc、Oct3/4、Klf），細(xì)胞去分化，重新獲得分化

6、潛能，同時其代謝方式也被同步轉(zhuǎn)換為糖酵解。由于這些細(xì)胞表現(xiàn)出在常氧條件下的嗜糖酵解特性，因此這種特性有時也被稱作做有氧糖酵解（Aerobic Glycolysis），而這些細(xì)胞內(nèi)總體代謝框架的改變也被稱為代謝重編程(Metabolic reprogramming)。現(xiàn)階段的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞干性重編程的過程偶聯(lián)了代謝重編程，盡管表觀遺傳修飾在這個過程中處于核心位置，但是大量的實(shí)驗(yàn)室研究強(qiáng)烈提示：代謝的可編程性是細(xì)胞重獲多潛能的先決條件。同時

7、研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將已分化的細(xì)胞暴露于低氧或者抑制其氧化磷酸化將有助于提高干性的重編程的效率；相反，通過刺激干細(xì)胞中的線粒體功能發(fā)育或者抑制糖酵解將會顯著提高 ATP的產(chǎn)量并促進(jìn)干細(xì)胞分化。
　　有趣的是，根據(jù)文獻(xiàn)記載，代謝重編程最早并非在干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，而是在高度惡性的腹水腫瘤細(xì)胞和肝癌組織中首次被記錄，早在1924年，一名叫Warburg的德國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，他所使用的小鼠腹水腫瘤細(xì)胞和大鼠肝癌組織即便在氧氣充足的情況下，仍然主要

8、依靠糖酵解進(jìn)行葡萄糖代謝提供能量，這些由葡萄糖分解產(chǎn)生的丙酮酸大部分經(jīng)乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為乳酸而排出細(xì)胞外。后來的研究發(fā)Warburg在文獻(xiàn)中描述的現(xiàn)象的本質(zhì)即有氧糖酵解，為了紀(jì)念Warburg的杰出貢獻(xiàn)，細(xì)胞進(jìn)行有氧糖酵解的現(xiàn)象也被稱作為 Warburg效應(yīng)（Warburg effect。近90余年來，Warburg效應(yīng)反復(fù)地在多種腫瘤細(xì)胞中被證實(shí)，目前被認(rèn)為是腫瘤的一個顯著特征，然而 Warburg效應(yīng)的背后所隱含的機(jī)制和生物學(xué)意義仍不

9、明確。由于這些研究將細(xì)胞的干性、代謝可塑性、Warburg效應(yīng)以及腫瘤聯(lián)系起來，因此，研究腫瘤的Warburg效應(yīng)理論上是研究腫瘤干細(xì)胞的一個有效手段。
　　基于這些背景知識和理論推導(dǎo)，我們集中研究了 Warburg效應(yīng)在前列腺癌發(fā)展過程中的地位，并探究了可能的機(jī)制。我們知道，線粒體氧化磷酸化和糖酵解是細(xì)胞中兩大產(chǎn)能途徑，其中丙酮酸是聯(lián)系糖酵解和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，干擾這一關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)可能改變線粒體氧化磷酸化和糖酵解相對比率，在正常

10、的已分化細(xì)胞中，由葡糖糖代謝生成的丙酮酸，首先由位于線粒體內(nèi)膜上的丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（mitochondrialpyruvate carrier，MPC）自胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體基質(zhì)，隨后在丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase complex，PDHc）的作用之下氧化脫羧，生成乙酰輔酶 A，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行氧化磷酸化；其中丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的E1α亞單位(PDHA1)的磷酸化和去磷酸化，是PDHc失活和激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)

11、方式，PDHA1蛋白的正常表達(dá)是線粒體中三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化正常進(jìn)行的前提條件。
　　鑒于上述，我們首先以PDHA1為切入點(diǎn)，用免疫組化的方法檢測前列腺癌組織中PDHA1蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理學(xué)特征以及預(yù)后的關(guān)系，初步了解能量代謝中的關(guān)鍵酶在前列腺癌中的表達(dá)情況；隨后在前列腺癌細(xì)胞系中敲除PDHA1，導(dǎo)致PDHc功能失活，分析PDHA1基因敲除后細(xì)胞中能量代謝的變化，同時研究了該細(xì)胞模型的細(xì)胞生物學(xué)與干細(xì)胞特征；此外，

12、我們應(yīng)用MPC特異性抑制劑UK5099處理前列腺癌細(xì)胞，分析處理前后細(xì)胞的能量代謝特點(diǎn)的變化，并分析處理前后細(xì)胞的生物學(xué)特性和干細(xì)胞特征，分析能量代謝變化與前列腺癌干細(xì)胞特性之間的聯(lián)系，目的在于探討能量代謝模式轉(zhuǎn)換是否可調(diào)控前列腺癌細(xì)胞干性程度。
　　第一部分：PDHA1蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)以及與預(yù)后的分析
　　研究方法
　　1.利用免疫組化的方法，檢測88例前列腺癌組織中PDHA1蛋白的表達(dá)情況。并分析PDHA

13、1蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征、患者生存期之間的關(guān)系。
　　2.應(yīng)用SPSS13.0軟件，采用單因素方差分析檢驗(yàn)PDHA1蛋白表達(dá)與各臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系；生存曲線采用Kaplan-Meier和log-rank分析檢驗(yàn)。
　　研究結(jié)果
　　1.在88例前列腺癌中，34(38.64％)例陽性表達(dá)PDHA1蛋白，54(61.36%)例為陰性，PDHA1蛋白表達(dá)與前列腺癌Gleason分級相關(guān)，Gleason分級小于7的27

14、例前列腺癌標(biāo)本中，15例(55.6%)為陽性，在Gleason分級等于7的41例標(biāo)本中14例(34.15.9%)為陽性，但在Gleason分級大于7的20例標(biāo)本中僅有5例(25%)為陽性性(p<0.05)，PDHA1蛋白表達(dá)與其它臨床病理學(xué)參數(shù)無相關(guān)性。
　　2.88例患者中PDHA1蛋白表達(dá)陰性者的患者，總生存率顯著低于PDHA1蛋白陽性患者(p<0.05)。
　　第二部分：PDHA1基因敲除對前列腺癌細(xì)胞代謝模式和干性程

15、度的影響
　　研究方法
　　1.構(gòu)建 TALEN質(zhì)粒，利用TALEN介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)在前列腺癌細(xì)胞LnCap中進(jìn)行了PDHA1基因的純合性敲除，挑選單克隆，建立穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　2.通過檢測細(xì)胞內(nèi)ATP、葡萄糖含量、以及應(yīng)用Seahorse Extracellular Flux24F能量代謝分析設(shè)備分析細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝偶聯(lián)的細(xì)胞氧耗（OCR）和胞外酸化速率（ECAR）的變化，分析敲除PDHA1基因后細(xì)胞代謝中糖酵解速

16、率和線粒體氧化磷酸化程度的變化。
　　3. PDHA1基因敲除后，用細(xì)胞計數(shù)法了解細(xì)胞增殖能力，Transwell assay了解遷移能力，Hoechst33342染色及流式細(xì)胞儀分析側(cè)群細(xì)胞（SP）比率，測試對化療藥物的敏感性，放療后的克隆形成實(shí)驗(yàn)了解放療敏感性，以及流式細(xì)胞儀和Western blot分析干細(xì)胞標(biāo)記CD44、ABCG2、Oct3/4、Nanog表達(dá)的改變。
　　研究結(jié)果
　　1.成功建立了PDHA1

17、基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　2. PDHA1基因敲除后，線粒體氧化磷酸化程度被抑制，糖酵解速率提高，表現(xiàn)為基礎(chǔ) OCR降低，基礎(chǔ) ECAR升高，葡萄糖攝取能力升高，ATP產(chǎn)量降低。
　　3. PDHA1基因敲除后，腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制，但是腫瘤細(xì)胞的體外移動能力增強(qiáng)，并且這些細(xì)胞呈現(xiàn)顯著的化療和放療抵抗，SP細(xì)胞比率增加，干細(xì)胞標(biāo)記CD44、ABCG2、Oct3/4、Nanog表達(dá)升高等，提示PDHA1基因敲除后的前列腺癌

18、細(xì)胞更加具有腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的特性。
　　第三部分：MPC抑制劑UK5099對前列腺癌細(xì)胞代謝模式和干性程度的影響
　　研究方法
　　1.用合適濃度的MPC抑制劑處理LnCap細(xì)胞。
　　2.以丙酮酸試劑盒、ATP試劑盒分析細(xì)胞胞漿中丙酮酸的濃度的變化、細(xì)胞ATP產(chǎn)量，以及使用線粒體膜電位JC-1探針和通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位的變化，初步分析細(xì)胞代謝中線粒體氧化磷酸化程度和糖酵解速率的轉(zhuǎn)變。
　　

19、2.用UK5099抑制丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體后，觀察LnCap細(xì)胞增殖的情況，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期、Hoechst33342染色及流式細(xì)胞儀分析側(cè)群細(xì)胞（SP）比率以及Western blot檢測干細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平的變化。
　　研究結(jié)果
　　1.應(yīng)用MPC抑制劑UK5099處理細(xì)胞，證實(shí)了UK5099可以抑制丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體基質(zhì)。
　　2. UK5099處理LnCap細(xì)胞后，ATP產(chǎn)量降低，乳酸產(chǎn)量增高，線粒體膜

20、電勢降低，提示線粒體氧化磷酸化程度收到抑制，糖酵解速率提高。
　　3. UK5099處理LnCap細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞G1/G0比例增加，SP細(xì)胞比率增加，干細(xì)胞標(biāo)記Oct3/4和Nanog表達(dá)升高。
　　研究結(jié)論
　　1.我們檢測PDHA1蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PDHA1蛋白陰性表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)，提示糖酵解通路可能在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。
　　2.敲除 PDHA1基因以