3D體外共培養(yǎng)模型中Cav1基因敲除的成纖維細(xì)胞對乳腺細(xì)胞增殖、遷移以及癌干細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：乳腺癌的發(fā)生并不僅僅與乳腺上皮細(xì)胞的病變有關(guān)，不同年齡階段的乳腺細(xì)胞處于不同的微環(huán)境中，其發(fā)病機(jī)制有所不同。但是現(xiàn)有的體外衰老研究模型都重點探討乳腺細(xì)胞發(fā)生衰老會產(chǎn)生的影響，并沒有明確地說明乳腺衰老微環(huán)境對乳腺細(xì)胞的影響，以及是否與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時，現(xiàn)有的體內(nèi)衰老模型中，大多采用衰老的小鼠模型作為體內(nèi)實驗的主要對象，然而其實驗周期長，外在影響因素多，影響實驗進(jìn)程。另外，大量研究已經(jīng)證明，微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞增殖生長以及侵襲

2、轉(zhuǎn)移的重要性，那么，在體外研究乳腺癌的病理機(jī)制性問題時，如果單純地探討乳腺細(xì)胞以及乳腺癌細(xì)胞，則會使得實驗結(jié)果與體內(nèi)的乳腺細(xì)胞生理微環(huán)境下的病理反應(yīng)有所出入，并不能完全地代表體內(nèi)真實的病理機(jī)制。多項研究表明，小窩蛋白1（Cav1）與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，在體內(nèi)，基質(zhì)Cav1重建癌旁和癌內(nèi)的微環(huán)境來促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并抑制細(xì)胞凋亡。因而本實驗室擬將建立體外的乳腺細(xì)胞衰老致癌模型，將正常的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞Cav1基因敲除，然后與乳腺細(xì)

3、胞進(jìn)行3D體外共培養(yǎng)，建立一個體外的衰老致癌的微環(huán)境模型，為今后的體外研究實驗盡可能地模擬人體內(nèi)生理微環(huán)境，從而為各種疾病的研究和治療提供更加有效的證據(jù)。
　　方法：首先選用不同的乳腺癌細(xì)胞系（MCF7和MDA-MB-231-GFP）、不同年齡 C57/GFP小鼠乳腺細(xì)胞以及人類女性乳腺細(xì)胞與正常成纖維細(xì)胞或者Cav1-KO成纖維細(xì)胞分別進(jìn)行3D體外共培養(yǎng)，分為：Cell3D組、+3T3組和+Cav1-KO組，培養(yǎng)15天后觀察測量

4、形成的3D結(jié)構(gòu)的形態(tài)、大小和個數(shù)；其次將3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行石蠟包埋后切片做免疫組織化學(xué)Ki67、p53、p63、γH2A.X、CK8、CK14等抗體染色；接著采用軟瓊脂集落形成實驗（Soft Agar Assay），驗證不同分組處理的乳腺細(xì)胞侵襲性和遷移性；最后將體外共培養(yǎng)形成的3D結(jié)構(gòu)再次消化形成單細(xì)胞懸液后，采用不同的細(xì)胞表面標(biāo)志物（ABCG2、CD201、CD24、CD44、CD49f、ALDH等抗體）進(jìn)行流式細(xì)胞分選分析，確定乳腺干細(xì)

5、胞以及乳腺癌干細(xì)胞的比例變化。
　　結(jié)果：NIH-3T3和Cav1-KO成纖維細(xì)胞都能夠促進(jìn)乳腺細(xì)胞3D形成率的增加，同時 Cav1-KO成纖維細(xì)胞明顯對年輕乳腺細(xì)胞、良性乳腺細(xì)胞以及癌細(xì)胞的3D形成率影響更大，而且3D形態(tài)差異較大，+Cav1-KO組花樣結(jié)構(gòu)的3D形成率增高；Ki67抗體IHC結(jié)果表示，Cav1-KO成纖維細(xì)胞能顯著性地促進(jìn)3D結(jié)構(gòu)中乳腺細(xì)胞增殖。CK8和CK14 IHC結(jié)果顯示，Cav1-KO成纖維細(xì)胞抑制CK

6、8和CK14在3D結(jié)構(gòu)細(xì)胞中的表達(dá)；并且，Cav1-KO明顯影響乳腺細(xì)胞核的形態(tài)，使之出現(xiàn)體積膨大、染色質(zhì)固縮和斷裂等衰老特征，結(jié)合γH2A.X和p53、p63等抗體IHC結(jié)果，以及Annexin V和7AAD等流式細(xì)胞分析，驗證了Cav1-KO成纖維細(xì)胞確實促使乳腺細(xì)胞惡性增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生衰老和癌前病變特性，同時正常的成纖維細(xì)胞抑制乳腺細(xì)胞凋亡。軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果顯示，Cav1-KO成纖維細(xì)胞增強(qiáng)乳腺細(xì)胞集落形成率，以及微

7、觸須結(jié)構(gòu)平均長度，ABCG2、CD201、CD24、CD44、CD49f、ALDH等乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志性抗體流式細(xì)胞分析實驗，結(jié)果顯示 Cav1-KO成纖維細(xì)胞顯著性增高乳腺癌干細(xì)胞的比例，并且正常成纖維細(xì)胞明顯地降低乳腺癌干細(xì)胞的比例。
　　結(jié)論：Cav1-KO成纖維細(xì)胞增強(qiáng)乳腺細(xì)胞基因損傷累積，激活DNA損傷反應(yīng)，磷酸化H2A.X蛋白，啟動p53信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和增殖反應(yīng)，尤其影響年輕乳腺管腔上皮祖細(xì)胞的生物學(xué)活性，導(dǎo)致其

8、分化惡變形成乳腺癌干細(xì)胞，增強(qiáng)乳腺細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)其侵襲性和遷移性，最終導(dǎo)致正常乳腺細(xì)胞發(fā)生衰老和癌前病變。與此相反，正常成纖維細(xì)胞能夠抑制乳腺細(xì)胞的惡性增殖，減少細(xì)胞凋亡，并降低乳腺細(xì)胞的基因損傷累積。該結(jié)論證明，微環(huán)境作為一把雙刃劍，可以為乳腺癌的治療提供有力的依據(jù)。綜上所述：本實驗乳腺癌體外衰老致癌模型可以應(yīng)用于正常細(xì)胞的敏感性篩選，癌癥治療藥物的篩選，以及體內(nèi)成瘤實驗等的前期藥物敏感性處理優(yōu)化等，為乳腺癌體外研究提供盡可能的體