氟胞嘧啶耐藥基因篩選及其機制研究.pdf

1、抗真菌藥物耐藥性已成為亟需解決的全球性難題，耐藥性引起的死亡率較高且難以治療，也是臨床抗真菌藥物治療失敗的主要原因。所以深入研究真菌耐藥機制并能控制和解決其耐藥性的發(fā)生，對國民的身體健康和社會的和諧發(fā)展有著非常重要的意義。臨床真菌對氟胞嘧啶（5-FC）易產生耐藥性，但機制非常復雜，本文試圖開展該藥物耐藥性新機制研究。
　　首先，在對5-FC耐藥菌株的篩選以及之后SDS-PAGE對高耐藥性菌株酵母總蛋白表達特性分析進行初步探索之后，

2、我們發(fā)現(xiàn)抗性菌株相比于野生型菌株蛋白含量明顯發(fā)生改變，但是通過誘變篩選的菌株對5-FC耐受性不具有特異性，特別是所得到的5-FC高耐受性菌株蛋白水平所表現(xiàn)出的差異可能是許多不同的基因共同調節(jié)的結果。為了篩選出對5-FC有特異耐受性的靶向基因，我們用過表達基因庫來篩選特異性抗5-FC的靶向基因，以期尋找5-FC耐受機制新途徑。
　　其次，我們通過釀酒酵母必需基因過表達庫的篩選，發(fā)現(xiàn)過表達ScGFA1基因后明顯提高了細胞對5-FC的耐

3、受性。已知GFA1基因參與了細胞壁中幾丁質的合成，首先用卡爾科弗盧爾熒光增白劑(CFW)染色法和熒光分光光度計檢測了細胞中幾丁質的含量，發(fā)現(xiàn)過表達ScGFA1提高了細胞中幾丁質的合成，而5-FC處理后細胞中幾丁質含量明顯下降。我們推測過表達ScGFA1對5-FC耐藥性的原因可能與細胞中幾丁質的合成有關。為此，進一步克隆構建了細胞幾丁質合成代謝途徑相關的一系列基因CRH1，GNA1,CHS2,PCM1,QRI1和CDA1，發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母野

4、生型菌株中過表達這些基因對5-FC也具有耐受性。值得注意的是幾丁質合成酶缺失突變體chs1Δ, chs3Δ對5-FC非常敏感，意味著幾丁質的合成與5-FC的耐受性具有密切的相關性。此外我們在幾丁質合成代謝的補救途徑中添加葡萄糖胺(Glc-N)，發(fā)現(xiàn)其可以使野生型菌株 BY4741對5-FC具有耐受性，而ScGFA1過表達菌株對5-FC的耐受性受到抑制。
　　此外，我們發(fā)現(xiàn)甘露糖蛋白合成代謝也影響幾丁質的合成，但其途徑十分復雜至今還

5、不清楚。我們觀察到甘露糖蛋白合成相關的某些基因CWP2,VRG1and MNT2的缺失也增加了幾丁質的合成。而甘露糖蛋白合成相關缺失突變體cwp2Δ,vrg1Δ和 mnt2Δ過表達ScGFA1也對5-FC具有耐受性。通過進一步克隆構建甘露糖蛋白合成相關基因CWP2,VRG4和MNT2，發(fā)現(xiàn)上調甘露糖蛋白的合成也能產生對5-FC的耐受性。最后我們利用高效液相色譜法（HPLC）檢測了細胞中糖核苷酸UDP-GLC的含量，發(fā)現(xiàn)5-FC處理后細胞

6、中UDP-GLC的含量明顯增加，結合前期我們發(fā)現(xiàn)的5-FC能降低細胞中幾丁質的合成，因此實驗結果表明5-FC可能通過抑制細胞壁中糖核苷酸的分解，進一步導致了細胞壁中幾丁質含量的下降，而過表達ScGFA1可以抵抗和彌補5-FC造成的這種損失。
　　最后在釀酒酵母中異源表達致病酵母白色念珠菌的CaGFA1，發(fā)現(xiàn)其對5-FC的耐受性同樣存在，并且白色念珠菌經5-FC處理后，細胞中幾丁質含量也明顯下降。因此過表達GFA1賦予5-FC的耐受