耐氟喹諾酮類抗菌藥豬鏈球菌的體外篩選及耐藥機(jī)制研究.pdf

1、鏈球菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥產(chǎn)生耐藥的機(jī)制主要有三種，一是藥物作用靶位的基因突變，二是細(xì)菌外排泵系統(tǒng)的過度表達(dá)，三是質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因的水平傳播。本課題從不同方面分析研究了豬鏈球菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥的耐藥機(jī)制，具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1人工誘導(dǎo)豬鏈球菌氟喹諾酮耐藥株的靶位突變分析
　　 以4株臨床分離的對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星敏感的豬鏈球菌2型菌株為研究對(duì)象，采用體外遞增藥物濃度的方法分別誘導(dǎo)了對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星耐藥的菌株，按CL

2、SI規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定了環(huán)丙沙星和恩諾沙星對(duì)親本株和誘導(dǎo)株的MIC，并測(cè)定了親本株和誘導(dǎo)株的生長(zhǎng)曲線，采用PCR和基因測(cè)序的方法分析了誘導(dǎo)株的DNA回旋酶（gyrA和gyrB）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（parC和parE）耐藥決定區(qū)(QRDR)的基因突變和氨基酸序列變化。結(jié)果表明：濃度遞增法可以成功誘導(dǎo)豬鏈球菌對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星耐藥，其MIC分別可由原來的0.5mg·L-1上升至128mg·L-1;各藥誘導(dǎo)耐藥株生長(zhǎng)均比其親本株慢；恩諾沙星與環(huán)

3、丙沙星誘導(dǎo)的耐藥菌在DNA回旋酶（gyrA和gyrB）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（parC和parE）耐藥決定區(qū)（QRDR）的基因和氨基酸序列變化有所不同，除了通常所報(bào)道的與喹諾酮耐藥相關(guān)的parC的Ser79Phe和gyrA的Ser81Arg的突變位點(diǎn)外，本試驗(yàn)還在耐藥菌中發(fā)現(xiàn)了gyrB的Asp315Asn、Ser285Leu、Glu354Lys及parE的Pro278Ser點(diǎn)突變，與部分文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。但是在誘導(dǎo)菌中還出現(xiàn)了一些不曾有報(bào)道的突

4、變位點(diǎn)和氨基酸的缺失，如gyrA的Gln118His、gyrB的288-291位和parC的62位氨基酸缺失以及parE的Asn297Tyr的突變，提示豬鏈球菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥的耐藥形成因素可能還有其他未發(fā)現(xiàn)的機(jī)制。
　　 2氟喹諾酮對(duì)臨床分離豬鏈球菌的防耐藥變異濃度測(cè)定及一步突變株的篩選
　　 分別用微量肉湯稀釋法（CLSI規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法）和瓊脂二倍稀釋法測(cè)定了四種氟喹諾酮抗菌藥（環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、甲磺酸培

5、氟沙星）對(duì)臨床分離的32株喹諾酮敏感的豬鏈球菌的體外最小抑菌濃度(MIC)和防耐藥變異濃度(MPC),并篩選一步突變耐藥株；分別與利血平和氰氯苯腙(CCCP)聯(lián)合用藥，檢測(cè)了各抗菌藥突變選擇窗(MSW)內(nèi)富集的一步耐藥突變株是否存在主動(dòng)外排泵機(jī)制；采用PCR和基因測(cè)序的方法檢測(cè)在不同藥物突變選擇窗內(nèi)篩選出的豬鏈球菌一步耐藥突變株的DNA回旋酶（gyrA和gyrB）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（parC和parE）耐藥決定區(qū)（QRDRs）的基因突變和氨

6、基酸序列變化，探明豬鏈球菌耐喹諾酮類藥物的作用機(jī)制，分析不同氟喹諾酮藥物在抑制豬鏈球菌時(shí)的特點(diǎn)，為臨床用藥提供依據(jù)。結(jié)果顯示：四種藥對(duì)豬鏈球菌的MIC值從小到大依次為：環(huán)丙沙星=恩諾沙星＜氧氟沙星＜甲磺酸培氟沙星，MPC值從小到大依次為：恩諾沙星＜氧氟沙星＜環(huán)丙沙星＜甲磺酸培氟沙星，選擇指數(shù)(MPC/MIC)除了環(huán)丙沙星為16之外其余藥物均為2；只在環(huán)丙沙星的耐藥突變窗內(nèi)篩選到了耐藥株，但其DNA回旋酶（gyrA和gyrB)和拓?fù)洚悩?gòu)酶

7、Ⅳ（parC和parE）耐藥決定區(qū)(QRDR)沒有堿基或氨基酸的突變；與利血平聯(lián)合用藥時(shí)檢測(cè)到了外排機(jī)制。
　　 3體外篩選的喹諾酮類耐藥豬鏈球菌對(duì)環(huán)丙沙星的蓄積動(dòng)力學(xué)研究
　　 采用微量肉湯稀釋法（CLSI規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法）測(cè)定鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)豬鏈球菌喹諾酮抗菌藥耐藥株的最小抑菌濃度(MIC)，并分別和利血平或氰氯苯腙(CCCP)聯(lián)合用藥探究其對(duì)豬鏈球菌喹諾酮耐藥株耐藥性的影響；用高效液相（HPLC）的方法分別測(cè)定豬鏈球菌