耐氟喹諾酮類抗菌藥豬鏈球菌的體外篩選及耐藥機制研究.pdf

1、鏈球菌對喹諾酮類抗菌藥產生耐藥的機制主要有三種，一是藥物作用靶位的基因突變，二是細菌外排泵系統(tǒng)的過度表達，三是質粒介導耐藥基因的水平傳播。本課題從不同方面分析研究了豬鏈球菌對喹諾酮類抗菌藥的耐藥機制，具體研究內容如下：
　　 1人工誘導豬鏈球菌氟喹諾酮耐藥株的靶位突變分析
　　 以4株臨床分離的對環(huán)丙沙星和恩諾沙星敏感的豬鏈球菌2型菌株為研究對象，采用體外遞增藥物濃度的方法分別誘導了對環(huán)丙沙星和恩諾沙星耐藥的菌株，按CL

2、SI規(guī)定的標準方法測定了環(huán)丙沙星和恩諾沙星對親本株和誘導株的MIC，并測定了親本株和誘導株的生長曲線，采用PCR和基因測序的方法分析了誘導株的DNA回旋酶（gyrA和gyrB）和拓撲異構酶Ⅳ（parC和parE）耐藥決定區(qū)(QRDR)的基因突變和氨基酸序列變化。結果表明：濃度遞增法可以成功誘導豬鏈球菌對環(huán)丙沙星和恩諾沙星耐藥，其MIC分別可由原來的0.5mg·L-1上升至128mg·L-1;各藥誘導耐藥株生長均比其親本株慢；恩諾沙星與環(huán)

3、丙沙星誘導的耐藥菌在DNA回旋酶（gyrA和gyrB）和拓撲異構酶Ⅳ（parC和parE）耐藥決定區(qū)（QRDR）的基因和氨基酸序列變化有所不同，除了通常所報道的與喹諾酮耐藥相關的parC的Ser79Phe和gyrA的Ser81Arg的突變位點外，本試驗還在耐藥菌中發(fā)現了gyrB的Asp315Asn、Ser285Leu、Glu354Lys及parE的Pro278Ser點突變，與部分文獻報道結果一致。但是在誘導菌中還出現了一些不曾有報道的突

4、變位點和氨基酸的缺失，如gyrA的Gln118His、gyrB的288-291位和parC的62位氨基酸缺失以及parE的Asn297Tyr的突變，提示豬鏈球菌對喹諾酮類抗菌藥的耐藥形成因素可能還有其他未發(fā)現的機制。
　　 2氟喹諾酮對臨床分離豬鏈球菌的防耐藥變異濃度測定及一步突變株的篩選
　　 分別用微量肉湯稀釋法（CLSI規(guī)定的標準方法）和瓊脂二倍稀釋法測定了四種氟喹諾酮抗菌藥（環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、甲磺酸培

5、氟沙星）對臨床分離的32株喹諾酮敏感的豬鏈球菌的體外最小抑菌濃度(MIC)和防耐藥變異濃度(MPC),并篩選一步突變耐藥株；分別與利血平和氰氯苯腙(CCCP)聯合用藥，檢測了各抗菌藥突變選擇窗(MSW)內富集的一步耐藥突變株是否存在主動外排泵機制；采用PCR和基因測序的方法檢測在不同藥物突變選擇窗內篩選出的豬鏈球菌一步耐藥突變株的DNA回旋酶（gyrA和gyrB）和拓撲異構酶Ⅳ（parC和parE）耐藥決定區(qū)（QRDRs）的基因突變和氨

6、基酸序列變化，探明豬鏈球菌耐喹諾酮類藥物的作用機制，分析不同氟喹諾酮藥物在抑制豬鏈球菌時的特點，為臨床用藥提供依據。結果顯示：四種藥對豬鏈球菌的MIC值從小到大依次為：環(huán)丙沙星=恩諾沙星＜氧氟沙星＜甲磺酸培氟沙星，MPC值從小到大依次為：恩諾沙星＜氧氟沙星＜環(huán)丙沙星＜甲磺酸培氟沙星，選擇指數(MPC/MIC)除了環(huán)丙沙星為16之外其余藥物均為2；只在環(huán)丙沙星的耐藥突變窗內篩選到了耐藥株，但其DNA回旋酶（gyrA和gyrB)和拓撲異構酶

7、Ⅳ（parC和parE）耐藥決定區(qū)(QRDR)沒有堿基或氨基酸的突變；與利血平聯合用藥時檢測到了外排機制。
　　 3體外篩選的喹諾酮類耐藥豬鏈球菌對環(huán)丙沙星的蓄積動力學研究
　　 采用微量肉湯稀釋法（CLSI規(guī)定的標準方法）測定鹽酸環(huán)丙沙星對豬鏈球菌喹諾酮抗菌藥耐藥株的最小抑菌濃度(MIC)，并分別和利血平或氰氯苯腙(CCCP)聯合用藥探究其對豬鏈球菌喹諾酮耐藥株耐藥性的影響；用高效液相（HPLC）的方法分別測定豬鏈球菌