5-氟胞嘧啶熱化療對裸鼠肝癌治療機(jī)理研究.pdf

1、目的：
　　 探討組織特異性胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系統(tǒng)熱化療對轉(zhuǎn)CD基因的肝癌SK-HEP-1細(xì)胞CD基因表達(dá)量有無影響；討論組織特異性CD/5-FC系統(tǒng)熱化療對裸鼠肝癌的抑制作用。
　　 方法：
　　 將質(zhì)粒PCD2和G1AFPCDNa在感受態(tài)細(xì)菌中大量擴(kuò)增,堿法抽提質(zhì)粒,質(zhì)粒PCD2用BamH1酶和EcoR1酶切鑒定,質(zhì)粒G1AFPCDNa用Sal1酶切鑒定并測序；用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染肝癌

2、SK-HEP-1細(xì)胞,以含400mg/IG418RPMI1640培養(yǎng)液選擇培養(yǎng),14天后挑選抗性克隆并大量擴(kuò)增,RT-PCR檢測目的基因的表達(dá)情況；在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別對兩種轉(zhuǎn)基因SK-HEP-1細(xì)胞進(jìn)行前藥5-FC熱化療,MTT法測活細(xì)胞比率并計(jì)算細(xì)胞殺傷率,并比較兩種轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞對5-FC的敏感性；隨后收集熱療后殘余SK-HEP-1-G1AFPCDNa細(xì)胞并抽提細(xì)胞總RNA,用實(shí)時熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測

3、熱化療前后SK-HEP-1-G1AFPCDNa細(xì)胞CD基因的表達(dá)情況,以比較熱化療前后目的基因表達(dá)有無差異。隨后將90只裸鼠隨機(jī)分為三組:對照組、AFPCD熱療組、AFPCD非熱療組,每組30只,脾內(nèi)注射法建立肝癌動物模型,對照組腹腔注射生理鹽水,熱療組腹腔注射43℃5-FC,非熱療組腹腔注射不加熱5-Fc,觀察各組裸小鼠的肝癌生成率、肝癌數(shù)目、光鏡以及電鏡下腫瘤組織病理學(xué)變化、腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù),裸鼠生存期等指標(biāo),RT-PCR檢測各組腫

4、瘤組織中CD基因的表達(dá)情況,同時檢測裸鼠胰腺,胃,結(jié)腸組織中CD基因有無表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 質(zhì)粒PCD2用BamH1酶和EcoR1酶切鑒定可見1.5k酶切片段；質(zhì)粒G1AFPCDNa用Sal1酶切鑒定可見1.9k酶切片段:基因測序與GenBank中公布的E-CD序列一致,脂質(zhì)體法將PCD2和G1AFPCDNa轉(zhuǎn)染肝癌SK-HEP-1細(xì)胞后,RT-PCR證明CD基因整合并能夠穩(wěn)定表達(dá),轉(zhuǎn)染G1AFPCDNa的肝癌S

5、K-HEP-1細(xì)胞比轉(zhuǎn)染PCD2的SK-HEP-1細(xì)胞CD基因的表達(dá)活性明顯增強(qiáng);5-FC轉(zhuǎn)基因細(xì)胞熱化療證明SK-HEP-1-G1AFPCDNa比SK-HEP-1-PCD2對5-FC更敏感,其IC50分別為0.12mmol/l和0.98mmol/l,表明在組織特異性驅(qū)動子TRS驅(qū)動下,目的基因的表達(dá)活性明顯增強(qiáng)；實(shí)時熒光定量PCR(Real-Time RT-PCR)檢測得到熱化療前CD基因表達(dá)的ct值29.53±1.1974,beta

6、-actinct值20.82±2.7385；熱化療后CD基因表達(dá)的ct值30.285±1.201,beta-actinct值21.225±2.237；行△△Ct法進(jìn)行相對定量比較無明顯差異(P>0.05,t=1.4521,v=38),表明熱療不會影響轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)活性。將成功轉(zhuǎn)染G1AFPCD基因的SK-HEP-1細(xì)胞注射脾臟,同時藥物干預(yù)后四周后,對照組有30只成瘤,成瘤率為100％；非熱療組有24只成瘤,成瘤率為80％；熱化組9只成

7、瘤,成瘤率為30％；腫瘤肝臟種植率非熱療組與對照組無明顯差異(P>0.05),而熱療組與對照組比較有顯著差別(P<0.01),平均肝癌數(shù)(x±s)對照組為13.6±8.79個,非熱療組為5.6±2.85個,熱療組為0.6±0.65個,熱療組與非熱療組平均肝癌數(shù)目明顯少于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；普通病理可見對照組腫瘤組織中,腫瘤細(xì)胞生長活躍,并可見細(xì)胞核分裂相和瘤巨細(xì)胞；而在非熱療組腫瘤組織中,瘤細(xì)胞數(shù)減少,腫瘤細(xì)胞空泡

8、變性,細(xì)胞核皺縮,邊集甚至消失,特別是在熱療組腫瘤組織標(biāo)本中更加明顯,僅殘留少量腫瘤細(xì)胞,并可見散在的成纖維細(xì)胞,淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞；透射電鏡下可見對照組腫瘤細(xì)胞呈不規(guī)則形,體積較大,核大,核仁明顯,核分裂相易見,細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富,但無明顯的凋亡小體；熱療組大量腫瘤細(xì)胞呈胞體凝縮,胞質(zhì)濃縮,核糖體及線粒體聚集,細(xì)胞核固縮,核碎裂等表現(xiàn),并可見大量有完整細(xì)胞膜包裹的凋亡小體,各組腫瘤標(biāo)本中均有CD基因的表達(dá),胰腺,胃,結(jié)腸組織中沒有

9、CD基因的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1脂質(zhì)體能將質(zhì)粒PCD2和G1AFPCDNa轉(zhuǎn)染入肝癌SK-HEP-1細(xì)胞,并且能穩(wěn)定整合持續(xù)表達(dá)。
　　 2轉(zhuǎn)染G1AFPCDNa的肝癌SK-HEP-1細(xì)胞比轉(zhuǎn)染PCD2的SK-HEP-1細(xì)胞CD基因的表達(dá)活性明顯增強(qiáng),表明AFP驅(qū)動子能驅(qū)動CD基因在SK-HEP-1細(xì)胞中高效表達(dá)。
　　 3轉(zhuǎn)染G1AFPCDNa的肝癌SK-HEP-1細(xì)胞比轉(zhuǎn)染PCD2的SK-HE

10、P-1細(xì)胞在43℃孵育下對前藥5-FC的敏感性明顯提高,表明在組織特異性驅(qū)動子TRS驅(qū)動下,目的基因的表達(dá)活性明顯增強(qiáng)。
　　 4轉(zhuǎn)染G1AFPCDNa的肝癌SK-HEP-1細(xì)胞熱化療前后CD基因表達(dá)量無差異,表明熱療不會影響CD基因在細(xì)胞及組織中的表達(dá)。
　　 5 SK-HEP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染基因后與未轉(zhuǎn)染基因細(xì)胞的致瘤性沒有發(fā)生變化。
　　 6熱療聯(lián)合組織特異性胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-Fc)系統(tǒng)腹腔