基于OATPs-oatps介導的麥冬皂苷D肝臟轉運的分子學機制研究.pdf

1、背景:
　　麥冬皂苷D(Ophiopogonin D, OPD)是參麥注射液的主要的活性成分之一,后者常與其他藥物聯(lián)用治療心腦血管疾病。近年來基于OATPs介導的中西藥相互作用屢見報道。課題前期研究發(fā)現(xiàn),大鼠分別靜脈給予參麥注射液或等同劑量的OPD后,前者血漿中OPD的濃度較高,其血/肝濃度比值可達后者給藥的5-7倍。OPD與OATPs/Oatps抑制劑聯(lián)用后,大鼠肝臟中OPD的濃度明顯減少,但血漿中OPD濃度增大,提示OPD可能

2、經(jīng)oatps介導攝取進入肝臟。因此,有必要通過體外細胞模型及質粒構建模型進一步深入研究OPD在肝臟攝取轉運的分子學機制。
　　目的:
　　通過構建大鼠原代肝細胞模型,從細胞學水平研究OPD在肝臟中的攝取轉運機制,初步推測OPD在大鼠原代肝細胞中的攝取與 oatps的內(nèi)在關聯(lián)性。然后,構建特異性高表達人 OATP1B1的質粒并通過轉染獲得穩(wěn)定高表達的HEK293T細胞模型,從分子學水平進一步深入探討OPD的肝臟轉運途徑及其機制

3、,探尋并揭示中藥組分與化學藥物之間基于OATPs介導的相互作用及配伍機理。
　　方法:
　　1、大鼠原代肝細胞中OPD的轉運機制研究
　?、倜骱徒⒋笫蟾渭毎麡颖局蠴PD的檢測方法和樣品處理方法
　　②建立大鼠原代肝細胞模型,在顯微鏡下觀察細胞形態(tài),采用臺盼藍測定肝細胞的細胞活率及產(chǎn)率。
　?、劭疾旆跤龝r間、細胞密度和藥物濃度對OPD攝取轉運的影響,確定最佳攝取條件,考察OPD的攝取動力學特征,求算Vma

4、x、Km等動力學參數(shù)。
　?、苎芯縪atps非特異性抑制劑利福平、瑞舒伐他汀對大鼠原代肝細胞中OPD攝取的影響,初步推測OPD肝臟轉運與oatps介導的相關性。
　?、葸x用oatps特異性抑制劑甘草酸、地高辛、四溴酚酞磺酸鈉及布洛芬,分別與OPD聯(lián)用,通過分析肝細胞中OPD濃度的變化,進一步確認OPD在大鼠肝細胞中攝取轉運的主要通路。
　　2、OATP1B1*1a-HEK293T細胞中OPD的轉運機制研究
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5、摸索和建立HEK293T細胞樣本中OPD的檢測方法和樣品處理方法。
　　②構建OATP1B1*1a-GFP質粒并感染HEK293T細胞,獲得高表達穩(wěn)定的細胞模型。
　?、塾枚∷徕c作用于OATP1B1*1a-HEK293T細胞,誘導OATP1B1基因的高表達,并通過瑞舒伐他汀攝取實驗,進一步驗證誘導模型是否成功。
　?、苎芯?OATP1B1*1a-HEK293T細胞中 OPD的轉運及其動力學特征,比較加 OATP1B1抑

6、制劑瑞舒伐他汀、利福平、四溴酚酞磺酸鈉以及甘草酸后 OPD肝臟轉運的變化,進一步深入闡明 OPD在OATP1B1*1a-HEK293T中的轉運機制。
　　結果:
　　1、大鼠原代肝細胞中OPD的轉運機制研究
　?、俳⒌拇笫蟾渭毎扑橐褐?OPD的 LC-MS測定方法專屬性較好,靈敏度高,符合樣本分析測試的相關要求。
　?、谠粌刹侥z原酶灌流法獲得大鼠原代肝細胞活力大于85％,得率約為0.8-1×108/肝,符合

7、藥物攝取實驗的要求。
　?、墼渭毎麛z取OPD在5-10 min迅速增加,10 min后達到飽和;大鼠原代肝細胞接種密度在0.25x106-2x106/ml范圍內(nèi),OPD的攝取隨著細胞密度的增加而增加;OPD濃度在1-32μΜ范圍內(nèi),其轉運量隨藥物濃度增加而增加,當濃度達到16μΜ時,轉運量增長趨于平緩,攝取達到飽和。根據(jù)米氏方程V=Vmax×[S]/( Km+S)計算,攝取動力學參數(shù) Km值為8.10μΜ, Vmax為54.3

8、9nmol-1.min-1.mg-1protein,Vmax/Km值為6.72。
　?、懿煌瑵舛鹊娜鹗娣ニ?5、10、20μM)對大鼠原代肝細胞中OPD的攝取表現(xiàn)出一定的抑制作用,與對照組相比,4μM OPD的攝取分別減少了8.6%、17.42%、32.53%;8μM OPD的攝取分別減少了9.36%、25.37%、40.18%;16μM OPD的攝取分別減少了9.27%、23.61%、32.21%。利福平(0.5、1、2、8μ

9、M))對OPD在大鼠原代肝細胞中的轉運無明顯抑制作用。與對照組相比,差異不具有統(tǒng)計學意義。
　?、輔atp1b2特異性抑制劑甘草酸(5、10、20、40μM)能顯著抑制OPD在大鼠原代肝細胞中的攝取,且隨著 GL濃度的增加,抑制作用加強,肝細胞中OPD的攝取分別減少了33.53%、39.92%、51.54%、57.50%,且具有極顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.01),抑制參數(shù)IC50為25.39μM。地高辛(oatp1a4特異性抑制劑

10、)、四溴酚酞磺酸鈉及布洛芬(oatp1a1特異性抑制劑)對OPD肝臟攝取幾乎無明顯抑制作用。
　　2、OATP1B1*1a-HEK293T細胞中OPD的轉運機制研究
　?、俳⒌腍EK293T細胞樣本中OPD的LC-MS測定方法專屬性較好,靈敏度高,符合樣本分析測試的相關要求。
　?、跇嫿ǖ腛ATP1B1*1a-GFP質粒感染HEK293T細胞,通過陰性病毒預實驗得出慢病毒MOI值為80時,感染率可達80%以上。然后攜

11、帶OATP1B1*1a目的基因的慢病毒去感染HEK293T細胞,隨著時間和MOI值的增加,熒光增強,提示重組細胞模型構建成功。
　?、跲ATP1B1*1a-HEK293T細胞經(jīng)丁酸鈉(1 mM)誘導48 h后,對經(jīng)典OATP1B1底物瑞舒伐他汀的攝取相當于未誘導組的2.3倍,證明模型誘導成功,可較好的用于下一步的OPD攝取轉運實驗。
　?、躉ATP1B1*1a-HEK293T細胞中OPD的攝取動力學參數(shù)Km與Vmax分別為5

12、.50μΜ與29.07 nmol.min-1.mg-1 protein。OATP1B1*1a-HEK293T細胞中瑞舒伐他汀的攝取動力學參數(shù) Km與 Vmax分別為24.42μΜ與15.02 nmol.min-1.mg-1 protein。通過比較Km值及Vmax可以得出,相對于瑞舒伐他汀,OPD與OATP1B1的親和力更強,且單位時間內(nèi)轉運速率更快。
　?、莶煌瑵舛鹊娜鹗娣ニ?2、10、50μM)對OATP1B1*1a-HEK

13、293T細胞中 OPD的攝取有一定的抑制作用,可使細胞中 OPD的攝取分別減少8.78±6.20%,29.23±9.58%,63.94±8.04%,抑制參數(shù)IC50為36.74μM。四溴酚酞磺酸鈉和利福平對OATP1B1*1a-HEK293T細胞中 OPD的攝取也具有抑制作用。不同濃度的四溴酚酞磺酸鈉(8、20、50μM)可使OPD的攝取分別減少3.93±8.63%,9.03±6.73%,32.42±9.43%。不同濃度的利福平(15、

14、30、60μM)可使OPD攝取減少24.77±6.09%,34.37±5.19%,52.90±5.56%,其抑制參數(shù)IC50為55.29μM。不同濃度的甘草酸(30、60、120μΜ)對OATP1B1介導的OPD的轉運也有較弱的抑制作用。使OATP1B1*1a-HEK293T細胞轉運OPD分別減少了7.61±9.02%,18.03±2.53%,20.83±4.66%。
　　結論:
　　①本實驗建立的大鼠肝細胞破碎液及HEK2

15、93T細胞樣本中OPD的LC-MS測定方法專屬性較好,靈敏度高,可用于相關樣本中OPD濃度的檢測。
　?、诒緦嶒灲⒌脑粌刹侥z原酶灌流法獲得的大鼠原代肝細胞活力較高,可用于肝細胞藥物攝取轉運及其機制研究。
　?、郾緦嶒灅嫿ǖ?OATP1B1*1a-HEK293T細胞誘導模型,OATP1B1表達穩(wěn)定且活性較高,可較好的用于人源性肝細胞的藥物轉運及其機制研究。
　?、躉PD在大鼠原代肝細胞中能被攝取,且在加入oatps非

16、特異性抑制劑瑞舒伐他汀(oatp1b2、oatp1a1及oatp1a4競爭性抑制劑)后,OPD的攝取明顯減少,提示大鼠原代肝細胞中OPD的攝取可能與oatps有關。進一步研究表明,oatp1b2特異性抑制劑甘草酸(5、10、20、40μΜ)競爭性抑制原代肝細胞中OPD的攝取,且隨濃度的增加,抑制作用越強。而利福平(oatp1a4和oatp1a1抑制劑)、地高辛(oatp1a4特異性抑制劑)、四溴酚酞磺酸鈉及布洛芬(oatp1a1抑制劑)

17、對OPD的攝取幾乎無明顯抑制作用。因此可以推斷,OPD在大鼠原代肝細胞中的攝取轉運與oatp1b2介導相關。
　?、軴PD在OATP1B1*1a-HEK293T細胞中能被攝取,相對于瑞舒伐他汀,O PD與OATP1B1的親和力更強,且單位時間內(nèi)轉運速率更快。OATP1B1競爭性抑制劑瑞舒伐他汀、四溴酚酞磺酸鈉、利福平及甘草酸均對OATP1B1*1a-HEK293T細胞中OPD的攝取有不同程度的抑制作用,進一步提示OPD是OATP1