NLRP3炎癥小體在高糖誘導(dǎo)NRK52E細(xì)胞微炎癥中的作用及黃芪甲苷干預(yù)研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　糖尿病人群中糖尿病腎病(Diabetic kidney disease，DKD)患病率約為20％～40％，是糖尿病的主要并發(fā)癥。隨著糖尿病患者人數(shù)快速增長(zhǎng)，DKD患病率逐年上升，一些國(guó)家和地區(qū)已將其列為終末期腎衰竭主要病因。DKD病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究顯示代謝紊亂、炎性反應(yīng)、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、遺傳因素、激肽系統(tǒng)及自噬等多種因素均起非常重要的作用。目前因治療手段有限，未能有效遏制DKD發(fā)生發(fā)展，在DKD進(jìn)入

2、ESRD階段后給患者、家庭及政府帶來(lái)沉重的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此針對(duì)DKD有效防治方法的研究亟待拓展。
　　微炎癥在糖尿病腎病中的重要性正日益凸顯。相對(duì)于適應(yīng)性免疫，固有免疫是糖尿病腎臟微炎癥反應(yīng)的驅(qū)動(dòng)因素。自1991年Cavallo等人首次發(fā)現(xiàn)2TDM患者血清中含有炎癥因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、干擾素、TNF-α，便開(kāi)啟針對(duì)DKD炎癥狀態(tài)的研究。這種免疫反應(yīng)在DKD中的主要過(guò)程是:在高糖的刺激下，單核細(xì)胞趨化蛋白

3、(monocyte chemotactic protein，MCP)-1、生成細(xì)胞間黏附分子(intercellularadhesion molecular-1，ICAM-1)，致使大量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腎臟固有細(xì)胞等參與炎性浸潤(rùn)，通過(guò)MAPK、IκB、JAK-STAT多種途徑，借由共同NF-κ B通路，對(duì)趨化因子、炎癥因子以及粘附因子等進(jìn)行激活，從而產(chǎn)生了促炎效應(yīng)，致使腎臟局部增生、硬化等情況持續(xù)發(fā)生。上述經(jīng)典炎癥促使單核細(xì)胞和淋巴

4、細(xì)胞募集，進(jìn)而激活并合成炎性分子，如活性氧和炎癥因子等。這種白細(xì)胞活性增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，推進(jìn)細(xì)胞損傷和腎纖維化進(jìn)程。研宄提示炎癥小體NLRP3通路、IL-1β、IL-18炎癥效應(yīng)因子等炎癥相關(guān)因素可能在多個(gè)層面影響著糖尿病腎病微炎癥狀態(tài)。而微炎癥作為腎臟纖維化的推手之一，促進(jìn)糖尿病腎病進(jìn)展。NLRP3炎癥小體作為與微炎癥密切相關(guān)的多組分蛋白復(fù)合物，其重要性于近年來(lái)固有免疫相關(guān)疾病中的各項(xiàng)研究中愈發(fā)凸顯，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在糖尿病腎病的病理變化

5、中具有重要意義。
　　近年來(lái)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明腎近端小管在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要，而這主要基于近端腎小管上皮細(xì)胞促纖維化及促炎癥的機(jī)制。這一病理進(jìn)展始于代謝異常，如尿蛋白、高糖、晚期糖基化終產(chǎn)物及其中間體、血管緊張素Ⅱ等代謝底物。其中高血糖是糖尿病最主要的代謝紊亂表現(xiàn)，亦是糖尿病腎病的重要誘因。高糖可經(jīng)由MAPK和PKC通路誘導(dǎo)PTECs產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子、趨化因子，如IL-1、CCL-2、ICAM-1、MCP-1、巨噬細(xì)胞炎

6、性蛋白-3a(macrophage inflammatory protein-3a，MIP-3a)。上述代謝異常將通過(guò)激活一系列的信號(hào)通路，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞分泌促炎癥、促纖維化分子，造成腎小管間質(zhì)纖維化及腎功能損傷，加速DKD進(jìn)展。
　　中醫(yī)理論對(duì)于糖尿病腎病炎癥的認(rèn)識(shí)主要體現(xiàn)于虛、痰、瘀、毒。其中氣虛是導(dǎo)致低度的、慢性的炎癥狀態(tài)的主要因素。黃芪是臨床常用補(bǔ)益類中藥，兼有升陽(yáng)舉陷、排膿斂瘡的功效，常用于治療氣虛乏力、慢性腎炎、糖

7、尿病等。在眾多中成藥及單味藥的研究中，黃芪被越來(lái)越多的臨床實(shí)踐及基礎(chǔ)研究證實(shí)具有良好的抗炎作用。黃芪甲苷(astragalosideⅣ，AS-Ⅳ)是黃芪的活性提取物。現(xiàn)代基礎(chǔ)及臨床研究均表明AS-Ⅳ在改善免疫功能紊亂、炎癥狀態(tài)等方面收效良好，一些研究發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ能夠通過(guò)對(duì)抗氧化應(yīng)激減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，從而改善糖尿病腎損傷。我們基于此猜想AS-Ⅳ能夠通過(guò)減輕微炎癥狀態(tài)、從而延緩DKD病程進(jìn)展。因此，本課題通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，從NLRP3炎

8、癥小體通路的角度探討AS-Ⅳ對(duì)DKD微炎癥的作用，同時(shí)探索相關(guān)分子機(jī)制，為糖尿病腎病的治療提供科學(xué)理論依據(jù)。
　　高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞NLRP3通路激活及黃芪甲苷干預(yù)（實(shí)驗(yàn)一）
　　目的:
　　觀察AS-Ⅳ對(duì)高糖誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活的抑制作用，并探索其機(jī)制。
　　方法:
　　用不同高糖濃度(5.5-65mM)和不同時(shí)間(0-48h)刺激NRK-52E細(xì)胞，觀察其對(duì)NRK-52E細(xì)胞活力、增殖的影

9、響。采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力。Western Blot法檢測(cè)NLRP3炎癥小體核心蛋白NLRP3的表達(dá)。選用不同劑量黃芪甲苷(10-80μ M)培養(yǎng)未加刺激的NRK-52E細(xì)胞24h，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)分為6組:正常對(duì)照組(NG)，滲透壓對(duì)照組(LG)，高糖對(duì)照組(HG)，AS-Ⅳ低、中、高劑量組(10，20，40μ MAS-Ⅳ)。通過(guò)Westernblot法來(lái)檢驗(yàn)凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC、半胱氨酸天冬氨酸激酶前體Pro-c

10、aspase-1、Caspase-1 P10的表達(dá)含量。內(nèi)參采用α-Tubulin。
　　結(jié)果:
　　CCK-8結(jié)果顯示高糖對(duì)細(xì)胞活力存在抑制作用，呈濃度依賴性;與正常糖對(duì)照組比較，25mM、45mM、65mM濃度的高糖組間有顯著性差異有(P＜0.05);45mM濃度的高糖組與65mM濃度的高糖組比較有顯著性差異(P＜0.05)。45mM高糖刺激24h，細(xì)胞活力下降至85.1％±0.1％(P＜0.05)，65mM高糖刺激24

11、h，細(xì)胞活力下降至58.2±0.1％(P＜0.01)。根據(jù)CCK-8結(jié)果，我們采用25mM高糖濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。NRK-52E細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)隨高糖濃度的增加而增加，35mM條件下達(dá)到最高值(7.44±4.23倍，P＜0.05)。高糖刺激不同時(shí)間點(diǎn)可見(jiàn)在9h時(shí)NLRP3表達(dá)至到最高水平(3.50±0.81倍，P＜0.05)，后逐漸下降，但與對(duì)照組比較仍有顯著差異。ASC蛋白表達(dá)同樣隨著高糖刺激濃度的增加而增多，當(dāng)高糖濃度達(dá)到25

12、mM時(shí)表達(dá)水平最高(3.80±1.09倍，P＜0.05)。高糖刺激時(shí)間為9h表達(dá)值最高，后表達(dá)逐步減少。Caspase-1在高糖濃度25mM條件下達(dá)到最高水平（3.70±1.23倍，P＜0.05）。高糖刺激9h時(shí)表達(dá)至最高水平（與0h比較，升高4.14±1.81倍，P＜0.05），后逐漸下降。AS-Ⅳ能夠下調(diào)高糖誘導(dǎo)的NLRP3蛋白表達(dá)水平，其中AS-Ⅳ中(20μM)、高劑量(40μM)與高糖組對(duì)比明顯差異(P＜0.05)，AS-Ⅳ低劑

13、量組(10μ M)與高糖組比較不存在明顯差異(P＞0.05)。AS-Ⅳ可以下調(diào)高糖誘導(dǎo)的ASC蛋白表達(dá)水平，其中AS-Ⅳ中(20μ M)、高劑量(40μ M)與高糖組比較有顯著性差異(P＜0.05)，AS-Ⅳ低劑量組(10μM)與高糖組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。AS-Ⅳ可以以調(diào)整劑量來(lái)下調(diào)高糖誘導(dǎo)的pro-caspase-1、caspase-1P10蛋白表達(dá)水平，其中AS-Ⅳ中(20μM)、高劑量(40μM)與高糖組對(duì)比，表明存

14、在明顯差異(P＜0.05)，AS-Ⅳ低劑量組(10μM)與高糖組對(duì)比不存在明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞微炎癥狀態(tài)導(dǎo)致NLRP3炎癥小體激活;AS-Ⅳ能夠抑制高糖誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體表達(dá)增加，分子機(jī)制是通過(guò)下調(diào)NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路，起到抑制腎小管炎性反應(yīng)的作用。
　　黃芪甲苷對(duì)高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞微炎癥的抑制作用（實(shí)驗(yàn)二）
　　目的:
　　

15、觀察AS-Ⅳ對(duì)高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞微炎癥狀態(tài)的抑制作用。
　　方法:
　　觀察濃度梯度AS-Ⅳ(10-80μM)對(duì)NRK-52E細(xì)胞活力的影響。采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力。用不同高糖濃度(5.5-65mM)和不同時(shí)間(0-48h)刺激NRK-52E細(xì)胞，Western Blot法檢測(cè)炎癥效應(yīng)因子前體pro-IL-1β、成熟體IL-1β的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為6組:正常對(duì)照組(NG)，滲透壓對(duì)照組(LG)，高糖對(duì)照組(HG)，A

16、S-Ⅳ低、中、高劑量組(10，20，40μM AS-Ⅳ)。通過(guò)Western Blot法來(lái)檢驗(yàn)炎癥效應(yīng)因子前體pro-IL-1β、成熟體IL-1β的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)炎癥效應(yīng)因子IL-18的表達(dá)。內(nèi)參采用α-Tubulin。
　　結(jié)果:
　　隨高糖濃度的增加，NRK-52E細(xì)胞pro-IL-1β、IL-1β蛋白表達(dá)逐漸增加，在高糖濃度20mM條件下達(dá)到最高水平（P＜0.05)。高糖刺激不同時(shí)間點(diǎn)可見(jiàn)在9h時(shí)pro-IL-

17、1β、IL-1β表達(dá)達(dá)到最高水平（與0h比較，P＜0.05），后逐漸下降，但與對(duì)照組比較仍有顯著差異。AS-Ⅳ能夠下調(diào)高糖誘導(dǎo)的pro-IL-1β、IL-1β蛋白表達(dá)水平，其中對(duì)于IL-1β，AS-Ⅳ中(20μ M)、高劑量(40μ M)與高糖組比較有顯著性差異（P＜0.05)，AS-Ⅳ低劑量組(10μM)與高糖組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。ELISA結(jié)果顯示，高糖刺激后細(xì)胞培液中IL-18濃度顯著高于正常糖對(duì)照組，呈劑量依賴性，2

18、5mM條件下達(dá)到最高水平（11.70±2.23倍，P＜0.05）。高糖刺激不同時(shí)間點(diǎn)可見(jiàn)在9h時(shí)IL-18濃度達(dá)到最高水平（與0h比較，升高3.14±1.81倍，P＜0.05)，后逐漸下降，但與對(duì)照組比較仍有顯著差異。給予20μM劑量的AS-Ⅳ的能夠顯著降低高糖刺激引起的IL-18表達(dá)水平提升，與高糖組比較有顯著性差異（P＞0.05）;AS-Ⅳ能夠下調(diào)高糖誘導(dǎo)的IL-18表達(dá)水平，其中AS-Ⅳ中(20μ M)、高劑量(40μ M)與高糖

19、組比較有顯著性差異（P＜0.05），AS-Ⅳ低劑量組(10μM)與高糖組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　AS-Ⅳ具有抑制高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞微炎癥作用，其分子機(jī)制是通過(guò)抑制炎性無(wú)活性前體pro-IL-1β活化途徑，抑制細(xì)胞內(nèi)微炎癥效應(yīng)因子IL-1β和IL-18表達(dá)，進(jìn)而抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞微炎癥反應(yīng)。
　　黃芪甲苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞抗纖維化作用（實(shí)驗(yàn)三）
　　目的:

20、r>　　觀察AS-Ⅳ對(duì)高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞纖維化的改善作用。
　　方法:
　　用不同高糖濃度(5.5-65mM)和不同時(shí)間(0-48h)刺激NRK-52E細(xì)胞，觀察濃度梯度AS-Ⅳ(10-80μ M)對(duì)NRK-52E細(xì)胞活力的影響。采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)分為5組:正常對(duì)照組(NG)，高糖對(duì)照組(HG)，AS-Ⅳ低、中、高劑量組(10，20，40μ M AS-Ⅳ)。Western Blot法檢測(cè)ECM主要成分纖

21、維連接蛋白Fibronectin、Ⅳ型膠原蛋白TypeⅣ Collagen的表達(dá)。內(nèi)參采用α-Tubulin。
　　結(jié)果:
　　Western blot結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞24h，能誘導(dǎo)細(xì)胞Fibronectin合成顯著增加，與正常糖對(duì)照組相比，差異具顯著性(P＜0.05); AS-Ⅳ能夠抑制高糖引起的Fibronectin蛋白水平的升高，并呈濃度依賴性，AS-Ⅳ中(20μM)、高劑量(40μ M)與高

22、糖組比較有顯著性差異(P＜0.05)，AS-Ⅳ低劑量組(10μM)與高糖組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。高糖環(huán)境下培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞24h后，可誘導(dǎo)細(xì)胞CollagenⅣ蛋白表達(dá)顯著增加，與正常對(duì)照組相比具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);AS-Ⅳ能夠抑制高糖引起的CollagenⅣ蛋白水平的升高，AS-Ⅳ低(10μM)、中(20μ M)、高劑量(40μ M)與高糖組比較有顯著性差異(P＜0.05);低劑量組(10μM)與正常對(duì)照組比較