HDAC6-p97-VCP調(diào)控“泛素化-自噬通路”逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)母細胞瘤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激耐受的相關機制研究.pdf

1、目的：
　　1.明確組蛋白脫乙?；敢种苿㏕ubastatin A協(xié)同替莫唑胺對膠質(zhì)瘤細胞耐藥株的殺傷作用；
　　2.探討組蛋白脫乙?；敢种苿㏕ubastatin A協(xié)同替莫唑胺殺傷膠質(zhì)瘤細胞耐藥株的機制。
　　材料與方法：
　　構(gòu)建四種不同膠質(zhì)瘤細胞系耐藥株，預先用Tubastatin A處理后，采用CCK-8法、Caspase-3凋亡檢測法、Hoechst33342/PI雙染法及Tunel法檢測細胞活力及凋

2、亡狀態(tài)。采用蛋白質(zhì)印記實驗及免疫共沉淀實驗檢測各個細胞系中組蛋白脫乙酰化酶6相關細胞信號通路的基因表達情況及相應分子之間作用。實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS19統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，所有定量實驗至少獨立重復3次，圖中的數(shù)據(jù)為平均值±標準差（mean±S.D.）。多組樣本方差假設相同市采用獨立樣本t檢驗，多組樣本方差明顯不同時，在用Bonferroni實驗矯正后采用Anova檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　

3、　1.Western blotting結(jié)果顯示：GRP78，磷酸化IRE1α，HDAC6在腫瘤組織樣本的表達水平高于正常腦組織中的表達水平；p97/VCP在腫瘤組織樣本的表達水平低于正常腦組織中的表達水平。GRP78，磷酸化IRE1α，HDAC6在TMZ耐藥株中的表達水平高于親本株中的表達水平；p97/VCPTMZ耐藥株中的表達水平低于親本株中的表達水平。
　　2．細胞活力及凋亡檢測結(jié)果顯示：CCK-8法檢測四種不同膠質(zhì)瘤細胞系中

4、，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中細胞凋亡情況明顯高于TUB單獨加藥組；四種腫瘤細胞系聯(lián)合用藥組的50％抑制濃度分別為A172組：15.5μM（P＜0.05）；U118組：8.2μM（P＜0.05）；U251組：11.7μM（P＜0.05）；U87組：17.3μM（P＜0.05）。Caspase-3活性檢測四種不同膠質(zhì)瘤細胞系中，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中細胞凋亡情況明顯高于TUB單獨加藥組。Hoechst33342/PI雙染法檢測A172膠

5、質(zhì)瘤細胞系，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中細胞凋亡情況明顯高于TUB單獨加藥組。Tunel法檢測A172膠質(zhì)瘤細胞系，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中細胞凋亡情況明顯高于TUB單獨加藥組。
　　3.Western blotting結(jié)果顯示：在膠質(zhì)瘤細胞系U87和U118中，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中未折疊蛋白質(zhì)反應及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關通路蛋白較TUB單獨加藥組中升高。
　　4.Western blotting及免疫共沉淀結(jié)果顯示：在膠質(zhì)瘤

6、細胞系U87和U118中，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中熱休克反應相關通路蛋白較TUB單獨加藥組中降低。
　　5.Western blotting、免疫共沉淀及免疫熒光結(jié)果顯示：膠質(zhì)瘤細胞系U87和U118中，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中HDAC6介導的相關自噬通路相關蛋白功能較TUB單獨加藥組中減弱；TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中p97/VCP介導的相關泛素-蛋白酶體通路相關蛋白功能較TUB單獨加藥組中增強。
　　結(jié)論：