HDAC6-p97-VCP調(diào)控“泛素化-自噬通路”逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激耐受的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.明確組蛋白脫乙?；敢种苿㏕ubastatin A協(xié)同替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥株的殺傷作用；
　　2.探討組蛋白脫乙酰化酶抑制劑Tubastatin A協(xié)同替莫唑胺殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥株的機(jī)制。
　　材料與方法：
　　構(gòu)建四種不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系耐藥株，預(yù)先用Tubastatin A處理后，采用CCK-8法、Caspase-3凋亡檢測(cè)法、Hoechst33342/PI雙染法及Tunel法檢測(cè)細(xì)胞活力及凋

2、亡狀態(tài)。采用蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞系中組蛋白脫乙酰化酶6相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路的基因表達(dá)情況及相應(yīng)分子之間作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，所有定量實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，圖中的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±S.D.）。多組樣本方差假設(shè)相同市采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組樣本方差明顯不同時(shí)，在用Bonferroni實(shí)驗(yàn)矯正后采用Anova檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　

3、　1.Western blotting結(jié)果顯示：GRP78，磷酸化IRE1α，HDAC6在腫瘤組織樣本的表達(dá)水平高于正常腦組織中的表達(dá)水平；p97/VCP在腫瘤組織樣本的表達(dá)水平低于正常腦組織中的表達(dá)水平。GRP78，磷酸化IRE1α，HDAC6在TMZ耐藥株中的表達(dá)水平高于親本株中的表達(dá)水平；p97/VCPTMZ耐藥株中的表達(dá)水平低于親本株中的表達(dá)水平。
　　2．細(xì)胞活力及凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：CCK-8法檢測(cè)四種不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中

4、，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中細(xì)胞凋亡情況明顯高于TUB單獨(dú)加藥組；四種腫瘤細(xì)胞系聯(lián)合用藥組的50％抑制濃度分別為A172組：15.5μM（P＜0.05）；U118組：8.2μM（P＜0.05）；U251組：11.7μM（P＜0.05）；U87組：17.3μM（P＜0.05）。Caspase-3活性檢測(cè)四種不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中細(xì)胞凋亡情況明顯高于TUB單獨(dú)加藥組。Hoechst33342/PI雙染法檢測(cè)A172膠

5、質(zhì)瘤細(xì)胞系，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中細(xì)胞凋亡情況明顯高于TUB單獨(dú)加藥組。Tunel法檢測(cè)A172膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中細(xì)胞凋亡情況明顯高于TUB單獨(dú)加藥組。
　　3.Western blotting結(jié)果顯示：在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U118中，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路蛋白較TUB單獨(dú)加藥組中升高。
　　4.Western blotting及免疫共沉淀結(jié)果顯示：在膠質(zhì)瘤

6、細(xì)胞系U87和U118中，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中熱休克反應(yīng)相關(guān)通路蛋白較TUB單獨(dú)加藥組中降低。
　　5.Western blotting、免疫共沉淀及免疫熒光結(jié)果顯示：膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U118中，TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中HDAC6介導(dǎo)的相關(guān)自噬通路相關(guān)蛋白功能較TUB單獨(dú)加藥組中減弱；TUB與TMZ聯(lián)合加藥組中p97/VCP介導(dǎo)的相關(guān)泛素-蛋白酶體通路相關(guān)蛋白功能較TUB單獨(dú)加藥組中增強(qiáng)。
　　結(jié)論：