自噬對Hemin處理后人膠質(zhì)瘤細胞U251的作用及相關機制探討.pdf

1、目的：研究hemin對星形膠質(zhì)細胞損傷后細胞內(nèi)自噬的變化、對細胞的作用以及相關機制。
　　方法：運用人膠質(zhì)瘤細胞U251，采用適當濃度的hemin（30μM）建立星形膠質(zhì)細胞體外腦出血模型—hemin損傷模型；CCK-8檢測人膠質(zhì)瘤細胞U251細胞的存活率；熒光染料碘化丙啶（PI）檢測hemin誘導的細胞質(zhì)膜完整性的破壞情況；Western Blot檢測不同的時間點12h、24h hemin處理后自噬相關蛋白LC3和凋亡相關蛋白

2、Bcl-2蛋白的表達；給予自噬抑制劑3-MA（10mM）及 mTOR抑制劑Rapamycin（100nM）后，通過CCK-8及免疫熒光技術檢測自噬在神經(jīng)細胞損傷中所起的作用；給予抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）后，CCK-8檢測人膠質(zhì)瘤細胞U251細胞的存活率，Western Blot檢測NAC對模型中星形膠質(zhì)細胞自噬相關蛋白LC3，和凋亡相關蛋白Bcl-2的影響；給予質(zhì)膜修復劑泊洛沙姆188（P188；100μM）后，通過CCK-8

3、檢測P188對hemin引起的神經(jīng)細胞損傷的影響。
　　結果：（1）成功利用hemin建立了體外星形膠質(zhì)細胞出血模型；CCK-8結果證實了hemin處理后對膠質(zhì)細胞的損傷作用，并且具有時間及濃度依賴性；PI熒光結果顯示 hemin處理后質(zhì)膜完整性遭到破壞；免疫熒光技術檢測發(fā)現(xiàn)，在ICH后12h及24h時，Hemin處理組與陰性對照組相比，自噬相關蛋白Beclin1的表達量明顯上升，而且TUNEL陽性細胞數(shù)增多。（2）hemin可以

4、誘導膠質(zhì)細胞發(fā)生自噬，且自噬在細胞死亡中扮演“雙刃劍”作用。CCK8法檢測發(fā)現(xiàn)，Hemin(30μM/L)處理U251細胞后，在12h3-MA能降低細胞的存活率，Rapmaycin能提高細胞的存活率；在24h3-MA能提高細胞的存活率，而Rapmaycin卻能降低細胞的存活率。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，Hemin(30μM/L)處理U251細胞后，在12h3-MA組Bcl-2蛋白水平與Hemin組相比明顯下調(diào)，Rapmaycin

5、組Bcl-2蛋白水平與Hemin組相比明顯上調(diào)；在24h3-MA組Bcl-2蛋白水平與Hemin組相比明顯上調(diào)，Rapmaycin組 Bcl-2蛋白水平與 Hemin組相比明顯下調(diào)。提示在體外腦出血模型中在不同的時間點自噬的作用不同。（3）抗氧化劑NAC能夠降低hemin引起的細胞損傷。Hemin與抗氧化劑NAC聯(lián)合使用，CCK-8檢測結果發(fā)現(xiàn)10 mM/L NAC的效果最好，提示抗氧化劑NAC能降低Hemin對U251細胞的損害作用。

6、Hemin與抗氧化劑NAC聯(lián)合使用后Western blot結果顯示，與對照組相比，在12h、24h LC3蛋白水平均顯著地下調(diào)，Bcl-2蛋白水平均顯著地上調(diào)，提示抗氧化劑 NAC通過下調(diào)自噬與凋亡的水平來減弱 Hemin對 U251細胞造成的氧化損傷，自噬可能處于hemin引起的氧化損傷的下游。（4）質(zhì)膜修復劑P188具有神經(jīng)保護作用。CCK-8結果發(fā)現(xiàn)，Hemin與質(zhì)膜修復劑泊洛沙姆188（P188）聯(lián)合使用，與陰性對照組相比細胞

7、的存活率明顯升高，我們發(fā)現(xiàn)100μM/L P188的效果最好，提示質(zhì)膜修復劑泊洛沙姆188能降低Hemin對U251細胞的損害作用。CCK-8結果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)膜修復劑P188與抗氧化劑NAC聯(lián)合使用，與單純給P188、NAC相比細胞的存活率都升高，提示質(zhì)膜修復劑泊洛沙姆188與抗氧化劑NAC作用的機制可能不同。
　　結論：1. Hemin對人膠質(zhì)瘤細胞U251具有明顯的生長抑制作用，并且有一定的時間和劑量依賴性，且伴隨有質(zhì)膜的破壞。2

8、. Hemin能誘導U251細胞發(fā)生凋亡與自噬，而且自噬在不同的時間點所起的作用不同：Hemin作用U251細胞后12h時，自噬起保護作用；Hemin作用U251細胞24h時，自噬促進細胞死亡，說明自噬是一把“雙刃劍”。3.Hemin對U251細胞的損傷作用主要是引起氧化損傷，抗氧化劑NAC的這種保護作用是通過下調(diào)凋亡來發(fā)揮作用，自噬可能處于氧化損傷過程的下游。4. Hemin對人膠質(zhì)瘤細胞U251的毒害作用會引起脂質(zhì)過氧化作用，引起質(zhì)