自噬對(duì)Hemin處理后人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的作用及相關(guān)機(jī)制探討.pdf

1、目的：研究hemin對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后細(xì)胞內(nèi)自噬的變化、對(duì)細(xì)胞的作用以及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：運(yùn)用人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，采用適當(dāng)濃度的hemin（30μM）建立星形膠質(zhì)細(xì)胞體外腦出血模型—hemin損傷模型；CCK-8檢測(cè)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞的存活率；熒光染料碘化丙啶（PI）檢測(cè)hemin誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)膜完整性的破壞情況；Western Blot檢測(cè)不同的時(shí)間點(diǎn)12h、24h hemin處理后自噬相關(guān)蛋白LC3和凋亡相關(guān)蛋白

2、Bcl-2蛋白的表達(dá)；給予自噬抑制劑3-MA（10mM）及 mTOR抑制劑Rapamycin（100nM）后，通過CCK-8及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)自噬在神經(jīng)細(xì)胞損傷中所起的作用；給予抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）后，CCK-8檢測(cè)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞的存活率，Western Blot檢測(cè)NAC對(duì)模型中星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3，和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的影響；給予質(zhì)膜修復(fù)劑泊洛沙姆188（P188；100μM）后，通過CCK-8

3、檢測(cè)P188對(duì)hemin引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響。
　　結(jié)果：（1）成功利用hemin建立了體外星形膠質(zhì)細(xì)胞出血模型；CCK-8結(jié)果證實(shí)了hemin處理后對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的損傷作用，并且具有時(shí)間及濃度依賴性；PI熒光結(jié)果顯示 hemin處理后質(zhì)膜完整性遭到破壞；免疫熒光技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在ICH后12h及24h時(shí)，Hemin處理組與陰性對(duì)照組相比，自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)量明顯上升，而且TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多。（2）hemin可以

4、誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生自噬，且自噬在細(xì)胞死亡中扮演“雙刃劍”作用。CCK8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Hemin(30μM/L)處理U251細(xì)胞后，在12h3-MA能降低細(xì)胞的存活率，Rapmaycin能提高細(xì)胞的存活率；在24h3-MA能提高細(xì)胞的存活率，而Rapmaycin卻能降低細(xì)胞的存活率。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Hemin(30μM/L)處理U251細(xì)胞后，在12h3-MA組Bcl-2蛋白水平與Hemin組相比明顯下調(diào)，Rapmaycin

5、組Bcl-2蛋白水平與Hemin組相比明顯上調(diào)；在24h3-MA組Bcl-2蛋白水平與Hemin組相比明顯上調(diào)，Rapmaycin組 Bcl-2蛋白水平與 Hemin組相比明顯下調(diào)。提示在體外腦出血模型中在不同的時(shí)間點(diǎn)自噬的作用不同。（3）抗氧化劑NAC能夠降低hemin引起的細(xì)胞損傷。Hemin與抗氧化劑NAC聯(lián)合使用，CCK-8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 mM/L NAC的效果最好，提示抗氧化劑NAC能降低Hemin對(duì)U251細(xì)胞的損害作用。

6、Hemin與抗氧化劑NAC聯(lián)合使用后Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在12h、24h LC3蛋白水平均顯著地下調(diào)，Bcl-2蛋白水平均顯著地上調(diào)，提示抗氧化劑 NAC通過下調(diào)自噬與凋亡的水平來減弱 Hemin對(duì) U251細(xì)胞造成的氧化損傷，自噬可能處于hemin引起的氧化損傷的下游。（4）質(zhì)膜修復(fù)劑P188具有神經(jīng)保護(hù)作用。CCK-8結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hemin與質(zhì)膜修復(fù)劑泊洛沙姆188（P188）聯(lián)合使用，與陰性對(duì)照組相比細(xì)胞

7、的存活率明顯升高，我們發(fā)現(xiàn)100μM/L P188的效果最好，提示質(zhì)膜修復(fù)劑泊洛沙姆188能降低Hemin對(duì)U251細(xì)胞的損害作用。CCK-8結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)膜修復(fù)劑P188與抗氧化劑NAC聯(lián)合使用，與單純給P188、NAC相比細(xì)胞的存活率都升高，提示質(zhì)膜修復(fù)劑泊洛沙姆188與抗氧化劑NAC作用的機(jī)制可能不同。
　　結(jié)論：1. Hemin對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，并且有一定的時(shí)間和劑量依賴性，且伴隨有質(zhì)膜的破壞。2

8、. Hemin能誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生凋亡與自噬，而且自噬在不同的時(shí)間點(diǎn)所起的作用不同：Hemin作用U251細(xì)胞后12h時(shí)，自噬起保護(hù)作用；Hemin作用U251細(xì)胞24h時(shí)，自噬促進(jìn)細(xì)胞死亡，說明自噬是一把“雙刃劍”。3.Hemin對(duì)U251細(xì)胞的損傷作用主要是引起氧化損傷，抗氧化劑NAC的這種保護(hù)作用是通過下調(diào)凋亡來發(fā)揮作用，自噬可能處于氧化損傷過程的下游。4. Hemin對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的毒害作用會(huì)引起脂質(zhì)過氧化作用，引起質(zhì)