人Sox2和Nanog基因克隆及其對胎肺成纖維細(xì)胞分化的影響.pdf

1、人Sox2和Nanog基因作為維持胚胎干細(xì)胞自我更新與全能性的關(guān)鍵基因，一直是科學(xué)研究工作的熱點(diǎn)。克隆人Sox2和Nanog基因，研究其分子生物學(xué)功能是本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)，得到目的序列與載體質(zhì)粒pSG連接，在大腸桿菌中擴(kuò)增來獲得重組質(zhì)粒pSG5-Sox2及pSG5-Nanog，為下一步轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。本實(shí)驗(yàn)選取胎兒肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，將測序成功的重組質(zhì)粒pSG5-Sox2及pSG5-Nanog轉(zhuǎn)染上述宿主細(xì)胞，觀察干細(xì)胞相關(guān)基因S

2、ox2和Nanog對于終末分化的體細(xì)胞形態(tài)及功能是否產(chǎn)生影響。
　　目的:
　　1克隆人Sox2、Nanog基因編碼序列，構(gòu)建pSG5-Sox2及pSG5-Nanog真核表達(dá)重組質(zhì)粒。
　　2原代培養(yǎng)胎肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞并傳代作為宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSG5-Sox2、pSG5-Nanog后檢測目的基因表達(dá)，觀察并鑒定宿主細(xì)胞分化方向。
　　方法:
　　1應(yīng)用RT-PCR方法分別從4～6周齡流產(chǎn)胎兒腦組織和

3、膀胱癌細(xì)胞中擴(kuò)增出Sox2及Nanog基因編碼全序列，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
　　2目的基因片段Sox2及Nanog雙酶切純化后將其分別連接到pSG5表達(dá)載體，構(gòu)成重組質(zhì)粒pSG5-Sox2、pSG5-Nanog，轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增后進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定后測序及序列比對。
　　3原代培養(yǎng)胎肺成纖維細(xì)胞并傳代，實(shí)驗(yàn)組將重組質(zhì)粒pSG5-Sox2及pSG5-Nanog用FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染胎肺成纖維細(xì)胞，以空質(zhì)粒pSG5用上

4、述方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對照，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入等量的低糖DMEM培養(yǎng)基作為陰性對照，倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　4轉(zhuǎn)染48h后，將3組胎肺成纖維細(xì)胞在六孔板中進(jìn)行爬片，采用RT-PCR方法，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測Sox2及Nanog基因表達(dá)情況。過表達(dá)重組質(zhì)粒，15～30d后進(jìn)行角蛋白(廣譜)，巢蛋白，膠質(zhì)纖維酸性蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫細(xì)胞化學(xué)染色，利用免疫反應(yīng)對細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的表達(dá)進(jìn)行定位。
　　結(jié)果:

5、r>　　1瓊脂糖凝膠電泳表明獲得人Sox2基因編碼序列(約1kb)和Nanog基因編碼序列(約1kb)。重組質(zhì)粒pSG5-Sox2、pSG5-Nanog菌落PCR產(chǎn)物電泳分別約1kb，雙酶切獲得質(zhì)粒片段pSG5(約4.1kb)及Sox2基因片段(約1kb)、Nanog基因片段(約1kb)，與理論值人Sox2基因編碼序列(957bp)，人Nanog基因編碼序列(934bp)及質(zhì)粒pSG5(4076bp)相符。重組質(zhì)粒測序后，在NCBI中B

6、LAST比對相似性均達(dá)到99％，表明所插入的目的片段正確。
　　2獲得穩(wěn)定傳代的胎肺成纖維細(xì)胞，RT-PCR方法，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)組Sox2、Nanog陽性表達(dá)，而空白對照組和陰性對照組中未檢測到相應(yīng)基因表達(dá)。
　　3倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前胎肺成纖維細(xì)胞呈典型的柵欄、漩渦狀生長。過表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染pSG5-Sox2、pSG5-Nanog8d后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)先呈現(xiàn)干細(xì)胞樣變化，15d后進(jìn)而分化為上皮樣細(xì)胞，排列緊密，呈扁

7、平多角形，免疫細(xì)胞化學(xué)角蛋白(廣譜)染色陽性；轉(zhuǎn)染20～30d后有向神經(jīng)細(xì)胞分化的趨勢，軸突明顯，部分細(xì)胞呈蜘蛛樣，胞質(zhì)突細(xì)長，免疫細(xì)胞化學(xué)巢蛋白、膠質(zhì)酸性纖維蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶染色陽性?？瞻讓φ蘸完幮詫φ战M未觀察有上述形態(tài)學(xué)改變，相關(guān)免疫細(xì)胞化學(xué)染色陰性。
　　結(jié)論:
　　本研究克隆了人Sox2、Nanog基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSG5-Sox2、pSG5-Nanog，轉(zhuǎn)染胎肺成纖維細(xì)胞并檢測到基因陽性表達(dá)，過表達(dá)重組