TRPM7對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、肺纖維化(pulmonaryfibrosis,PF)是一種嚴(yán)重的肺間質(zhì)疾病,主要病理特點(diǎn)是早期的彌漫性肺泡炎,后期大量成纖維細(xì)胞病理性增殖轉(zhuǎn)型及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)進(jìn)行性異常積聚并取代正常的肺組織結(jié)構(gòu)[1]。肺纖維化發(fā)病受多種因素的共同影響,尤其是大量細(xì)胞因子的刺激作用,使成纖維細(xì)胞(FB)不斷地增殖和轉(zhuǎn)型為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MB)[2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),肺纖維化的發(fā)病率

2、、死亡率不斷上升,而且隨著年齡的增長(zhǎng),其發(fā)病率和死亡率也逐漸升高。目前,對(duì)PF的藥物治療主要以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主,但效果均不理想[3]。深入探討其發(fā)病機(jī)制,尋找新的藥物靶點(diǎn),一直是國(guó)內(nèi)外藥物研究的熱點(diǎn)。
　　瞬時(shí)受體電位通道(transientreceptorpotentialchannels,TRPchannel)是位于細(xì)胞膜上的一類重要的陽(yáng)離子通道,瞬時(shí)受體電位通道7(TRPM7)是TRP家族成員之一,是一種具有陽(yáng)離子

3、通道和蛋白激酶雙重結(jié)構(gòu)的雙功能膜蛋白,可使自身或底物磷酸化,也被稱為“通道酶”[4,5]。文獻(xiàn)報(bào)道,TRPM7廣泛存在于機(jī)體組織中,參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、凋亡等多種生理病理過(guò)程[6,7],并在纖維化疾病的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用[8,9]。但其在肺纖維化中的作用還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)選用人胚肺成纖維細(xì)胞系MRC-5為研究對(duì)象,觀察TRPM7對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖及分化的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容概括如下:<

4、br>　　1.TRPM7在人胚肺成纖維細(xì)胞系MRC-5中的表達(dá)
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TGF-β1刺激人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5,RT-PCR和Westernblot檢測(cè)MRC-5中TRPM7的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,TGF-β1刺激組,TRPM7的表達(dá)明顯高于正常組。
　　2.抑制TRPM7表達(dá)對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞系MRC-5增殖及分化的影響
　　采用MTT比色法測(cè)定TRPM7非特異性阻斷劑Gd3+或2-APB對(duì)MRC-5的增殖抑

5、制率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MRC-5周期變化;RT-PCR檢測(cè)TRPM7、α-SMA、Collagen?mRNA的表達(dá)變化;Westernblot檢測(cè)α-SMA、Collagen?蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,Gd3+或2-APB能夠不同程度的降低MRC-5中TRPM7mRNA的表達(dá),并且在一定范圍內(nèi)抑制MRC-5的增殖。進(jìn)一步研究TRPM7對(duì)MRC-5細(xì)胞周期的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TRPM7阻斷劑Gd3+或2-APB可通過(guò)促使細(xì)胞聚積于G0/G1期

6、,降低G2/M期及S期細(xì)胞,影響MRC-5細(xì)胞的增殖。同時(shí),Gd3+或2-APB能夠降低MRC-5中α-SMA、Collagen?的mRNA和蛋白的表達(dá),表明下調(diào)TRPM7的表達(dá)可抑制MRC-5的增殖和分化。
　　利用LipofectamineTM2000將特異性的TRPM7-siRNA轉(zhuǎn)染到MRC-5中,下調(diào)TRPM7在人胚肺成纖維細(xì)胞系MRC-5中的表達(dá)。分別運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MRC-5細(xì)胞周期的影響;RT-PCR及Weste

7、rnblot法檢測(cè)TRPM7、α-SMA、Collagen?mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,TRPM7-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖受到抑制,肺纖維化標(biāo)志性蛋白α-SMA、Collagen?的表達(dá)顯著下降。
　　3.TRPM7對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞系MRC-5中PI3K/AKT信號(hào)通路的影響
　　給予TGF-β1體外誘導(dǎo)肺纖維化模型,再分別給予PI3K/AKT通路特異性阻斷劑LY294002、離子通道阻斷劑Gd3+、2

8、-APB處理,MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率,Westernblot法檢測(cè)p-Akt、t-Akt蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示,與正常組比較,TGF-β1明顯促進(jìn)MRC-5的增殖,而給予LY294002干預(yù)后,MRC-5的增殖明顯受到抑制,同時(shí)TGF-β1能顯著促進(jìn)MRC-5p-Akt蛋白的表達(dá),當(dāng)使用LY294002、Gd3+、2-APB處理后,p-Akt蛋白表達(dá)均受到抑制,t-Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TRPM7-siRNA轉(zhuǎn)染組