以端粒為靶點(diǎn)的神經(jīng)氧化損傷的治療新途徑及其作用機(jī)制探討.pdf

1、目的：心腦血管意外、膿毒血癥和急性肺損傷等急危重癥，均產(chǎn)生大量活性氧離子（ROS）降低了急救后臟器復(fù)蘇的成功率。神經(jīng)細(xì)胞的不可再生性，使缺氧、ROS聚積和氧化應(yīng)激對其造成不可逆的氧化損傷。因此，腦復(fù)蘇是急救領(lǐng)域的治療瓶頸。最新研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷是氧化和抗氧化作用失衡的重要病理生理后果，影響細(xì)胞代謝和組織功能。端粒位于真核細(xì)胞線狀染色體末端 DNA-蛋白復(fù)合體，它與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成了特殊的染色體末端“帽子”結(jié)構(gòu)，保持染色體的完整性和

2、抑制DNA損傷。因此，探索以端粒為靶點(diǎn)抑制DNA損傷的抗氧化應(yīng)激治療可能是提高腦復(fù)蘇的新途徑。本文首先證明博來霉素、ICRF-193等介導(dǎo)的氧化應(yīng)激能直接或間接破壞端粒特異性蛋白TRF2，激活γ-H2AX等DNA損傷信號，提出保護(hù)端粒，能降低 DNA損傷和氧化損傷的毒性作用。進(jìn)而用小鼠神經(jīng)氧化損傷模型證明TRF2通過維護(hù)端粒結(jié)構(gòu)和加強(qiáng)端粒的抗氧化作用，在神經(jīng)組織中有重要保護(hù)作用，闡明其機(jī)制與抑制 DNA損傷和消除Aβ和磷酸化 Tau等介

3、導(dǎo)神經(jīng)氧化損傷的因子有關(guān)。
　　方法：基因毒性藥物ICRF-193導(dǎo)致HT1080細(xì)胞DNA損傷，細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)敲除TRF2表達(dá)，免疫熒光檢測細(xì)胞 DNA損傷變化。提取野生型小鼠和APPSwe/PS1dE9C57BL/6模型小鼠的腦組織蛋白、DNA、 RNA，利用Western Blot等技術(shù)檢測小鼠腦組織及其它組織中TRF2蛋白含量。RT-PCR檢測TRF2在腦組織及其它組織中的表達(dá)量。PNA FISH技術(shù)分析小鼠腦組織端粒長度變

4、化。左心灌流提取腦組織，免疫熒光染色技術(shù)，檢測腦組織和小鼠腦原代神經(jīng)元TRF2表達(dá)情況。檢測神經(jīng)元中 TRF2蛋白和γH2AX蛋白表達(dá)，及神經(jīng)元形態(tài)變化。在SHSY5Y細(xì)胞中，過表達(dá)Tau，用免疫熒光，Western Blot等技術(shù),分析P-tau及γH2AX變化。過表達(dá)TAU的SHSY5Y細(xì)胞通過 siRNA抑制TRF2轉(zhuǎn)錄表達(dá)，檢測 DNA損傷蛋白表達(dá)。體外構(gòu)建 Aβ寡聚體，不同濃度的寡聚體加入敲除或過表達(dá)TRF2等不同條件的SHS

5、Y5Y細(xì)胞中，檢測DNA損傷蛋白γH2AX及TRF2的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴TRF2具有保護(hù)端粒結(jié)構(gòu)，防止DNA損傷的作用。⑵APPSwe/PS1dE9C57BL/6小鼠原代神經(jīng)元 TRF2表達(dá)升高,DNA損傷加重,神經(jīng)元形態(tài)無明顯改變。⑶Aβ1-42寡聚體引起 SHSY5Y細(xì)胞 DNA損傷加重，敲低 TRF2后加重 Aβ1-42寡聚體的對細(xì)胞的DNA損傷。⑷過表達(dá)TAU的細(xì)胞 P-Tau表達(dá)上升，DNA損傷加重。⑸過表達(dá)TAU的S

6、HSY5Y細(xì)胞再敲低TRF2，導(dǎo)致DNA損傷加重。⑹APPSwe/PS1dE9C57BL/6小鼠腦TRF2的表達(dá)高于野生型小鼠，隨著年齡增長其表達(dá)增加。
　　結(jié)論：TRF2可以維持端粒的結(jié)構(gòu)，防止基因毒性藥物造成的DNA損傷。TRF2在腦組織高表達(dá)，APPSwe/PS1dE9C57BL/6小鼠小鼠中腦組織TRF2相比較于野生型小鼠腦組織表達(dá)升高，且隨年齡增加上升，表明TRF2對神經(jīng)具有保護(hù)功能，進(jìn)一步通過體外構(gòu)建過表達(dá)Tau蛋白的