以組織因子為靶點的腫瘤免疫治療結合物的制備和純化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景和目的:
  化學藥物治療作為惡性腫瘤治療方法中重要的一部分,與適于局限性腫瘤的外科學手術治療和放射治療有著本質的不同,是腫瘤綜合治療的重要手段之一,盡管采用多藥聯(lián)合、大劑量化療等手段不斷改善腫瘤化療的療效,受個人耐受情況及化療藥劑量依賴性毒性的影響,化療藥物的治療效果仍受到限制,傳統(tǒng)化療藥物的治療效果似乎進入平臺期。腫瘤靶向治療藥,能特異性的結合腫瘤細胞上特異性表達的分子結構,具有高選擇性、低毒等傳統(tǒng)化療藥所不具有的優(yōu)點

2、,眾多腫瘤靶向治療藥物表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果,靶向藥物是目前腫瘤化療藥物研究的熱點之一。
  組織因子(tissue factor,TF)從其凝血功能研究開始發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系,不僅與腫瘤患者血液高凝狀態(tài)相關從而引起腫瘤患者靜脈血栓形成,其誘導的凝血級聯(lián)反應及與之相關的信號途徑等機制與促進腫瘤血管形成、腫瘤轉移和腫瘤生長有關,近年來TF與腫瘤干細胞之間聯(lián)系性的提出為腫瘤的難治、復發(fā)提供了新的線索。且在多種惡性腫瘤

3、中檢測到TF異常增高表達。
  Hu等[1,2]設計的抗體類似物,由編碼點突變(K341A)hfVII和免疫球蛋白效應片段(IgG1Fc)構成的免疫結合物(Immnoconjugate,Icon)在應用于包括黑色素瘤、前列腺癌、和乳腺癌等動物模型上時表現(xiàn)出顯著效果,使移植瘤消退,但是,動物實驗表現(xiàn)出該結合物對小鼠的凝血功能有一定影響的研究下。本研究在分析fVII晶體結構發(fā)現(xiàn)fVII由輕鏈和重鏈組成,輕鏈中EGF和Gla區(qū)與TF緊密

4、結合有關,而重鏈則與凝血反應有關。且利用編碼fVII輕鏈與IgG1Fc的腺病毒載體在結直腸癌動物模型中表現(xiàn)出良好的抗血管治療作用。
  本研究利用分子克隆技術,構建hfVII-LC+IgG1Fc的真核細胞表達載體,轉入CHO-K1細胞中體外獲得hfVII-LC+IgG1Fc免疫結合物,以期減少hfVII對凝血功能的影響及腺病毒載體對肝功能的損害。
  研究內(nèi)容和方法:
  第一部分:TF在腫瘤細胞中的表達
  采

5、用免疫熒光方法檢測HT-29及NB4細胞株上TF的表達情況。
  第二部分:hfVII-LC+hIgG1Fc蛋白的制備和純化
  1、分別從健康人外周血單個核細胞和肝組織中提取總RNA。
  2、采用RT-PCR方法分別擴增hIgG1Fc及hfVII-LC基因片段。
  3、用BamH I、EcoR I分別雙酶切hfVII-LC PCR擴增產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)質粒,T4 DNA連接酶作用下連接,然后轉化D

6、H5a感受態(tài)細胞,篩選Amp抗性克隆,用PCR、雙酶切及測序方法鑒定陽性克隆pcDNA3.1(+)--hfVII-LC,用同樣的方法及EcoR I、Xho I內(nèi)切酶構建pcDNA3.1(+)--hfVII-LC+hIgG1Fc最后酶切及測序方法鑒定陽性克隆。
  4、以脂質體法轉染陽性質粒入中國倉鼠卵巢細胞亞株 CHO-K1細胞,G418加壓篩選獲得陽性單克隆細胞,用半定量RT-PCR鑒定轉染是否成功。
  5、Excell

7、302無血清擴大培養(yǎng),培養(yǎng)液Ni-NTA親和層析純化和制備hfVII-LC+hIgG1Fc融合蛋白,純化后蛋白,BCA法測蛋白濃度??捡R斯亮藍檢測親和層析純度。
  6、ELISA法檢測不濃度融合蛋白與TF的靶向作用。
  第三部分:噬菌體肽庫序貫篩選TF靶向肽
  1、分別以純化TF蛋白和具有TF高特異性表達的結直腸癌細胞株HT-29為靶分子,用噬菌體七肽庫進行序貫篩選。
  2、ELISA初步鑒定噬菌體克隆對

8、HT-29親和力。
  3、噬菌體克隆進行測序,利用競爭抑制 ELISA比較各合成肽的TF結合力。
  結果:
  第一部分:
  免疫熒光法檢測HT-29及NB4細胞膜呈現(xiàn)強紅色熒光表達,表明有TF異常高表達,陰性對照則基本不發(fā)出熒光信號。
  第二部分:
  1、分別從肝組織及外周血單個核細胞提取總RNA,經(jīng)紫外分光光度計測的OD260/280在1.8-2.0之間,表明RNA純度較高,且RNA于瓊

9、脂糖電泳條帶清晰,完整。
  2、分別以肝組織及外周血單個核細胞總RNA為模板RT-PCR方法可分別擴增出696bp和456bp大小的兩段基因片段,測序結果符合目的基因序列。
  3、pcDNA3.1(+)--hfVII-LC+hIgG1Fc真核表達載體的構建
  使用特異引物進行RT-PCR,從肝組織和淋巴細胞中擴增得到目的基因片段,將其插入pcDNA3.1(+)真核表達載體,構建成pcDNA3.1(+)--hfVI

10、I-LC+hIgG1Fc重組載體。經(jīng)BamH I、EcoR I和Xho I三酶切,可見約5.4kb、696bp和456bp大小的三條帶,分別為酶切后的載體片段及兩條目的片段。將 pcDNA3.1(+)--hfVII-LC+hIgG1Fc陽性重組子進行 DNA測序,測序結果與 Genebank中的hfVII-LC、hIgG1Fc序列完全吻合,且?guī)в芯幋a6×His標簽蛋白序列。說明pcDNA3.1(+)--hfVII-LC+hIgG1Fc真

11、核表達載體構建成功。
  4、RT-PCR檢測hfVII-LC+hIgG1Fc mRNA的表達
  對CHO-K1-hfVII-LC+hIgG1Fc細胞的總RNA進行RT-PCR擴增,結果擴增出大小為456bp的hfVII-LC條帶,大小為1152bp的hfVII-LC+hIgG1Fc條帶以及GAPDH大小為327bp。在相同RT-PCR擴增條件及加樣量下,同步轉染空質粒CHO-K1細胞無特異目的條帶。
  5、SDS

12、-PAGE凝膠檢測通過Ni-NTA樹脂純化后蛋白的純度和分子量大小
  收集的無血清培養(yǎng)基經(jīng)過Ni-NTA樹脂純化純化后得到較純的目的蛋白分子量大小為55-70KD之間。經(jīng)western blot檢測純化后的蛋白帶有His標簽蛋白。
  6、ELISA檢測hfVII-LC+hIgG1Fc蛋白與TF的親和力:分別檢測5個不同稀釋度0,0.01,0.1,1和10mg/mL hf-LC+hIgG1Fc與TF的結合能力,在450/6

13、30nm雙波長下分別測定其OD值:(各平行對照孔取平均值)分別為0.091±0.0012、0.283±0.0014、0.385±0.03、0.464±0.0116和0.765±0.0012(P<0.05)。OD值越高說明合成的免疫結合物與TF的結合增加,其中加入免疫復合物孔的OD值都高于未加入孔,提示免疫結合物與TF有親和力,且呈劑量依賴性。
  第三部分:
  1、回收率由于淘選出與 TF特異性親和性增加隨機七肽庫回收率由

14、2.25×10-4%增加到1.32×10-2%。
  2、隨機挑選的30個陽性噬菌體克隆與HT-29細胞上TF結合活性由ELISA初步鑒定以OD值為陰性對照值(0.64)3倍以上即為陽性,其陽性率為76.7%。
  3、按噬菌體DNA測序結果重復率高的基因序列人工合成多肽A、B、C、D、E,與抗TF抗體行ELISA競爭抑制法,分別讀取OD值換算成IC50分別為3.25nM、6.72M、3.24×103M、2.08×102 M

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