海藻糖低溫保存血小板miRNA差異表達(dá)研究.pdf

1、血小板在離體保存過程中結(jié)構(gòu)和功能會隨時間延長而發(fā)生形態(tài)和功能的變化，這些改變統(tǒng)稱為儲存損傷（PSL）?，F(xiàn)在臨床使用的血小板制劑在22℃振蕩保存常規(guī)條件下最長可以保存5天。為了減少血小板的儲存損傷，延長血小板保存時間，人們嘗試采用低溫保存方法，它雖可以延長保存時間，但低溫也可致血小板發(fā)生活化，使血小板功能減低并導(dǎo)致其在受者體內(nèi)很快被清除。研究表明，海藻糖能抑制血小板的儲存損傷并且減少凋亡的發(fā)生，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。微小RNA（mi

2、RNA）是由內(nèi)源基因編碼而成的一種小分子非編碼RNA（sncRNAs），長度約為21～22個核苷酸的單鏈RNA分子，主要功能是靶向抑制特異的信使RNA（mRNA）參與胞內(nèi)的調(diào)控過程，參與機(jī)體的多種生物學(xué)過程；血小板雖為無核的細(xì)胞，但其胞內(nèi)含有豐富的 miRNA，在血小板儲存損傷的過程中起重要作用。血小板miRNA與儲存損傷的研究多基于PCR或者芯片方式，本研究首次使用第二代高通量測序技術(shù)，通過檢測海藻糖低溫保存血小板時的 miRNA表達(dá)

3、改變，為進(jìn)一步探索海藻糖保護(hù)低溫血小板的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　目的:探討海藻糖低溫保存血小板過程中miRNA變化。
　　方法:收集3份來自相同血型無償獻(xiàn)血者的單采血小板，混勻后，第一次對照組：新鮮血小板組（22℃，100％血漿儲存的血小板2h）；實驗組：海藻糖低溫保存血小板組（10℃，70%海藻糖保存液儲存5 d）。第二次實驗對照組：添加70%未加入海藻糖的血小板添加液10℃震蕩保存5天；實驗組：添加70%海藻糖保存液

4、10℃震蕩保存五天。采用高通量測序方法對兩組樣品進(jìn)行了小 RNA測序，進(jìn)行生物信息分析，主要包括已知miRNA鑒定、miRNA差異表達(dá)分析及富集分析。
　　結(jié)果:2組樣品經(jīng)測序后，平均每個樣品獲得了11兆凈讀值（Clean reads），通過差異表達(dá)分析，海藻糖低溫保存前后比較，在已知的 miRNA中共有460個差異表達(dá)miRNA，其中有統(tǒng)計學(xué)意義差異表達(dá)已知miRNA共44個，分別在鈣離子通路、MAPK通路、凋亡路徑、軸突導(dǎo)向等

5、儲存損傷相關(guān)路徑中富集程度較高。相對于對照組，實驗組中hsa-miR-4449、hsa-miR-1296表達(dá)顯著上調(diào)（p值<0.05，且差異倍數(shù)≥2），hsa-miR-665表達(dá)被抑制。
　　低溫保存血小板過程加入海藻糖后，多個儲存損傷相關(guān)信號通路出現(xiàn)差異，包括MAPK通路、光傳導(dǎo)通路、p53信號通路、VEGF信號通路、流感A通路、凋亡路徑等。其中多種相關(guān)miRNA表達(dá)出現(xiàn)改變，如hsa-miR-2277-5p上調(diào)，hsa-miR

6、-4707-3p、hsa-miR-136-3p和hsa-miR-431-3p顯著上調(diào)，hsa-miR-188-5p表達(dá)下調(diào)，hsa-miR-28-5p表達(dá)顯著下調(diào)。
　　結(jié)論:血小板經(jīng)過海藻糖低溫保存后的 miRNA呈現(xiàn)出特征性表達(dá)變化，提示海藻糖通過hsa-miR-2277-5p、hsa-miR-4707-3p、hsa-miR-188-5p、hsa-miR-28-5p調(diào)控蛋白激酶B(Akt)表達(dá)增加，Bcl-2、IAP、MKP顯