深低溫保存血小板制備與質量控制

1、,由于冰凍保存血小板有良好的臨床止血效果和可根據(jù)需要長期大量庫存的優(yōu)點，理想的血小板冰凍保存技術研究日益受到關注。血小板是成份輸血的重要部分，它對各種原因引起的血小板減少，起到了藥物不可替代的治療作用。血小板的臨床止血效果，與所輸注的血小板數(shù)量和質量關系密切。正確掌握冰凍保存血小板的整個制備過程中的制備技術和質量控制方法，才能提高我們制備的血小板的得率和質量。,簡單流程,離心機,冰箱,血小板,,,ACD200ml采血袋全血,,,全

2、血,簡單流程,,,DMSO,-80℃,冰凍血小板,,,血小板,,,冰凍血小板,血小板,,,DMSO,所需儀器設備,超濾DMSO裝置G6漏斗、電動吸引器,全自動血細胞計數(shù)儀,德國Heraeus離心機Cryofuge 8000或6000I,超凈工作臺,血細胞分離機,-80℃低溫冰箱,38℃循環(huán)式水浴箱,分漿夾、熱合機,24G頭皮針一次性10ml無菌注射器,稱量儀、自動加樣器,冰凍保護劑DMSO準備,,,G6漏斗、收集瓶、分裝瓶的準

3、備將G6漏斗、收集瓶、分裝瓶先用長水沖洗，硫酸-高錳酸鉀液浸泡24小時，流水沖洗后用雙蒸水沖洗、浸泡，然后包裝，通過高壓蒸汽消毒（136℃，6-8分鐘）。,,超濾后500ml/瓶分裝好避免光，置于潔凈環(huán)境室溫保存。,DMSO的超濾和保存在無菌間，超凈工作臺中，將購置的DMSO用G6漏斗負壓抽濾。,冰凍血小板制備方法,,從全血采集到制備血小板的全過程，均要求在22±2℃環(huán)境中6小時內完成（包括離心溫度）。即使不立即制備，也不

4、要將全血放入冰箱4℃保存，以免影響血小板質量。,冰凍血小板制備方法,冰凍血小板制備方法,新鮮富含血小板血漿（FPRP）制備最佳離心分離條件選擇,,離心是制備冰凍富含血小板血漿最重要的環(huán)節(jié)之一。選擇最佳離心條件的目的，是為了使獲得的富含血小板血漿中血小板濃度較高，而紅細胞、白細胞污染少。選擇最佳離心條件的方法需要根據(jù)各單位的具體條件來確定。,最佳離心條件選擇方法,,我科采用析因設計確定最佳離心條件。測定ACD全血、FPRP內血小板計數(shù)和

5、FPRP體積，計算所得血小板數(shù)和血小板得率，確定最佳離心條件。,冰凍血小板制備方法,,室溫(18-22℃左右)條件下，用三聯(lián)采血袋采集健康獻血者ACD-B抗凝全血200ml。要求采血流暢，采血時間＜3min。預實驗表明采用德國Heraeus Cryofuge 8000和6000I離心機，加速度為9檔，減速度為4檔的條件下，在400-650g離心5-11min 血小板得率較高。,冰凍血小板制備方法,,冰凍血小板制備方法,,,,二因素,離心

6、力,離心時間,400g,480g,560g,650g,5min,7min,9min,11min,四水平,組合成16種離心條件,,,通過計算各條件下血小板得率，同時參考白細胞和紅細胞污染率，選取最佳離心條件。,冰凍血小板制備方法,冰凍血小板制備方法,結果,,22℃±2℃條件下，采用德國Heraeus Cryofuge 8000離心機，加速度為9檔，減速度為4檔，480g，離心7min條件下，平均得率為70%。紅細胞污染≤1

7、15;109/單位；白細胞污染≤5×107/單位。,冰凍血小板制備方法,,從ACD全血離心制備的FPRP質量，不僅與離心機的離心速度有關，而且與血液體積、血球壓積、離心機啟動加速度和減速度密切相關。其中離心機性能非常重要。,冰凍血小板制備方法,,由于離心后ACD全血中的紅細胞壓得不緊，容易因為振搖和非勻速運動而泛起，混入FPRP中。共振明顯的離心機不適于制備富含血小板血漿。合適的離心機減速度檔選擇低檔較好。,冰凍血小板制備方法

8、,,離心時要采取措施如仔細系綁等，防止血袋在離心杯內出現(xiàn)皺折或塌伏，減少分離時紅細胞污染。,冰凍血小板制備方法,,離心完畢，要輕拿輕放，盡量減少搬動次數(shù)。最好將離心好的血液直接從離心杯中輕輕轉移到分漿夾中。分離上層FPRP應該用止血鉗控制速度。速度以慢為好，至少要先快后慢。否則將會減少血小板得率，增加紅細胞和白細胞污染。,冰凍血小板制備方法,添加冰凍保護劑DMSO,,二甲基亞砜在冰凍血小板中作用,冰凍血小板制備方法,,二甲基亞砜（DM

9、SO）:化學試劑、分析純、分子式：C2H6OS、分子量：78.13，凝點約18.3-18.5℃、沸點：189-192℃，比重：1.099-1.109g/ml,為無色稀薄液體、略帶苦味，易吸潮、具特殊臭味（大蒜樣味）。,冰凍血小板制備方法,,本藥品口服及皮膚給藥均易吸收，皮下注射4-8小時，一部分以原形從尿中排泄、還有少部分經(jīng)肺排出。,冰凍血小板制備方法,,DMSO在冰凍血小板中主要作為一種防凍劑，保護血小板膜。在緩慢加入DMSO時，DM

10、SO將血小板包圍起來，既起到保護作用又可抑制血小板的凝集、聚合作用。,冰凍血小板制備方法,,DMSO有抑菌作用，DMSO濃度為8%時，能抑制92%的綠膿桿菌生長、濃度為15%時，能抑制９８％的大腸桿菌和巨大芽胞桿菌生長、但高濃度使用本品不能代替滅菌。,冰凍血小板制備方法,,DMSO使用前要經(jīng)G6漏斗濾除雜物、細菌、熱原質等。裝放在潔凈無菌的玻璃瓶中，室溫保存。,DMSO添加方法,,離心后輕輕分離上層新鮮PRP（FPRP），經(jīng)過稱量，在潔

11、凈的環(huán)境中采用無菌技術，用一次性10ml注射器和24G頭皮針緩慢（＞5min）加入超濾DMSO，終濃度為5% 。,冰凍血小板制備方法,,需要添加DMSO量的簡單計算方法：DMSO（ml）=富含血小板血漿（ml）×0.05在加入DMSO過程中，要用一定強度充分混勻，避免局部產(chǎn)熱。盒裝后直接放入-85℃冰箱保存。,冰凍血小板制備方法,冰凍血小板制備方法,,5%DMSO在室溫下2-3小時內對血小板通常無明顯毒性作用。加入5%DM

12、SO后，血小板激活標志物CD62p（P選擇素）和磷脂酰絲氨酸陽性率稍微增加，這與DMSO加入方式有關。,冰凍血小板制備方法,,將高濃度的DMSO加入FPRP中會有局部產(chǎn)熱現(xiàn)象，如果加入過快，可使局部溫度過高，引起血小板激活。,冰凍血小板制備方法,,CD62p陽性率升高幅度與DMSO添加的速度和混合方式密切相關。過快的添加速度和劇烈振蕩可以使CD62p陽性率明顯升高。在DMSO加入的過程中，人工添加要求采取正確的振蕩方式和合適的添加速度。

13、最好采用機械自動加入和自動搖床，有利于操作標準化和質量控制。,富含血小板血漿質控,,※ 檢測獻血者外周血血小板計數(shù) 要求獻血者PLT＞150×109/L※ 要求分離后血小板個數(shù)＞2.0×1010個/袋 紅細胞污染≤1×109/U 白細胞污染≤5×107/U※ 每月抽樣5袋，做血小板，白細胞 紅細胞計數(shù)，細菌培養(yǎng)，及五項實驗 （A

14、LT，HBsAg，HCV，HIV，USR）,機采濃縮血小板冰凍保存,,取機采新鮮濃縮血小板，在潔凈的環(huán)境中采用無菌技術，用一次性10ml注射器和24G頭皮針往血小板收集袋中，緩慢（＞10分鐘）加入超濾DMSO，終濃度為5%。需要添加DMSO量的簡單計算方法同上。折疊好，盒裝后直接放入-80℃冰箱保存。,冰凍血小板解凍和使用,,根據(jù)患者需要的治療劑量，取出相應數(shù)量的冰凍PRP，置于38-42℃循環(huán)式水浴箱快速解凍。 輸注方法同液體保存