刺頭復葉耳蕨總黃酮對人臍帶間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　研究刺頭復葉耳蕨總黃酮（total flavonoids from arachniodes exilis，TFAE)在人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）成骨分化中的作用，并進一步研究雌激素受體（estrogen receptor，ER）信號途徑在其中的作用。
　　方法：
　　(1)采用組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)hUCMSC

2、s，倒置相差顯微鏡觀察細胞形3 hUCMSCs
　　(2)TFAE對hUCMSCs活性的影響：實驗分為5組：0μg/mLTFAE組(對照組)，1μg/mLTFAE組，5μg/mLTFAE組，10μg/mLTFAE組，20μg/mLTFAE組，分別作用24h、48h、72h后，CCK-8法檢測細胞活性。
　　(3)TFAE對hUCMSCs成骨分化的影響：根據(jù)細胞活性檢測結果，實驗分為4組：對照組（常規(guī)培養(yǎng)基），0μg/mLTF

3、AE組（0μg/mLTFAE的成骨誘導培養(yǎng)基），1μg/mLTFAE組（1μg/mLTFAE的成骨誘導培養(yǎng)基），5μg/mLTFAE組（5μg/mLTFAE的成骨誘導培養(yǎng)基），誘導培養(yǎng)3d、7d后，AMP法測定ALP活力；誘導培養(yǎng)14d后，茜素紅染色檢測鈣結節(jié)，RT-PCR檢測成骨相關基因Ⅰ型膠原a1(collagen type I alpha1, Col1a1)、骨橋蛋白(osteopotin, OPN)、Runx2、Osterix（

4、Osx）mRNA表達水平。
　　(4)ER在hUCMSCs成骨分化中的作用：實驗分為4組：對照組（0μg/mLTFAE的成骨誘導培養(yǎng)基），TFAE組（5μg/mLTFAE的成骨誘導培養(yǎng)基），TFAE+S組（5μg/mLTFAE的成骨誘導培養(yǎng)基+S1191），S組(S1191），誘導培養(yǎng)3d、7d后，AMP法測定ALP活力；誘導培養(yǎng)14d后，茜素紅染色檢測鈣結節(jié)，RT-PCR檢測成骨相關基因Col1a1、OPN、Runx2、Osxm

5、RNA表達水平。
　　結果：
　　(1)臍帶組織貼壁培養(yǎng)3-5d后，培養(yǎng)皿中有細胞長出，培養(yǎng)10-14d，組織塊周圍長滿成纖維樣細胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細胞形態(tài)均一，貼壁良好。
　?。?）細胞活性檢測結果：CCK-8檢測結果顯示，與對照組相比，1μg/mLTFAE組、5μg/mLTFAE組細胞活性明顯增強（P＜0.05或P＜0.01），10μg/mLTFAE組、20μg/mLTFAE組細胞活性明顯減弱（P＜0.05或P＜0

6、.01）。
　?。?）hUCMSCs成骨分化檢測結果：1）ALP檢測結果顯示：與對照組相比，0μg/mLTFAE、1μg/mLTFAE組及5μg/mLTFAE組細胞ALP活力明顯增強（P＜0.05或P＜0.01），與0μg/mLTFAE組，1μg/mLTFAE組及5μg/mLTFAE組細胞ALP活力也明顯增強（P＜0.05或P＜0.01）；2）茜素紅染色結果顯示：不同濃度TFAE組均有鈣結節(jié)形成，而對照組未見鈣結節(jié)，與0μg/mL

7、TFAE組相比，1μg/mLTFAE組及5μg/mLTFAE組鈣結節(jié)數(shù)量明顯增多（P＜0.01）；3）RT-PCR檢測結果顯示：與對照組相比，0μg/mLTFAE組、1μg/mLTFAE組及5μg/mLTFAE組成骨相關基因 Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表達量明顯增加（ P＜0.01），與0μg/mLTFAE組相比，1μg/mLLTFAE組及5μg/mLTFAE組Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表達量

8、也明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。
　?。?）ER抑制劑作用下，hUCMSCs成骨分化檢測結果：
　　1）ALP檢測結果顯示：與對照組相比，TFAE組細胞ALP活力明顯增強（P＜0.01），與TFAE組相比，TFAE+S組細胞ALP活力明顯減弱（P＜0.05或P＜0.01），對照組與S組無差異；
　　2）茜素紅染色結果顯示：各組均有鈣結節(jié)形成，與對照組相比，TFAE組鈣結節(jié)數(shù)量增多（P＜0.01），而與TFAE

9、組相比，TFAE+S組鈣結節(jié)數(shù)量明顯減少（P＜0.01），對照組與S組無差異；
　　3）RT-PCR檢測結果顯示：與對照組相比，TFAE組成骨相關基因Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表達量明顯增加（P＜0.01），與TFAE組相比，TFAE+S組Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表達量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），對照組與S組無差異。
　　結論：
　?。?）一定濃度的TFAE增強