髓過氧化物酶響應(yīng)性納米粒的構(gòu)建及在炎癥成像和治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、響應(yīng)性納米材料的設(shè)計和合成一直是納米醫(yī)學關(guān)注的熱點問題。納米載體不僅具有改善藥物組織分布，影響藥物體內(nèi)代謝的特點，還能實現(xiàn)診斷、治療等功能的一體化。但如何使藥物能夠特異性的分布于病灶和靶標部位，就需要更加有效的遞送策略。自上世紀70年代首次提出響應(yīng)性納米遞送系統(tǒng)的理念后，已有大量實驗和應(yīng)用研究取得了諸多進展。利用溫度、磁場、光照等外源性刺激和pH、酶、氧化還原系統(tǒng)等諸多內(nèi)源性物質(zhì)的改變，使藥物及成像、診斷試劑能夠特異性的分布和富集于靶標

2、部位，用于諸如炎癥、心血管功能障礙及腫瘤等多類疾病的診斷和治療。當前研究中，外源性信號響應(yīng)性納米遞送系統(tǒng)因需施加后續(xù)外源性干預，過程相對較為繁瑣，長期應(yīng)用性也較為困難；而在內(nèi)源性信號響應(yīng)性納米遞送系統(tǒng)中，基于疾病微環(huán)境改變，具備診斷和治療功能的納米材料，雖多有研究，但同時具有酶響應(yīng)性無創(chuàng)成像能力，且具備治療特性的納米遞送系統(tǒng)亦鮮有報道。
　　基于以上問題，本課題提出設(shè)想：以小分子發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol）為功能單元，將其鍵合

3、于FDA批準的生物相容性分子β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin,β-CD），可以得到髓過氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）響應(yīng)性的化學發(fā)光材料bCD-Lu；以其制備化學發(fā)光納米粒(Nanoparticle,NP)，用于炎癥的無創(chuàng)成像。為驗證此假設(shè)，在成功合成bCD-Lu的基礎(chǔ)上，對其納米粒的理化性能和體外發(fā)光特性進行了深入表征。同時，基于多種急性炎癥模型對bCD-Lu納米粒的體內(nèi)成像功能進行了深入評價，并在多種炎癥

4、模型中研究了其治療效果。由此，成功構(gòu)建了具有MPO響應(yīng)性的多功能納米遞送系統(tǒng)。
　　方法:
　　1.Luminol鍵合β-CD功能材料bCD-Lu的合成
　　稱取0.68gβ-CD和0.68g N,N'-carbonyldiimidazole（CDI）于圓底燒瓶中，加入6mL無水DMF溶解并以N2保護，室溫下攪拌1.5h后，將反應(yīng)混合物緩慢加入4℃無水乙醚中沉淀，抽濾后，將沉淀重新加入8mL無水DMF中溶解，并稱取0.

5、318g luminol加入其中，室溫下攪拌反應(yīng)15h。隨后，將產(chǎn)物緩慢加入蒸餾水中沉淀，8500rpm離心6min，棄去上清液，加入25mL蒸餾水渦旋清洗2次、并離心收集，冷凍干燥2天，得bCD-Lu白色粉末。
　　2.bCD-Lu及水解產(chǎn)物的表征
　　取bCD-Lu溶于DMSO-d6，掃描核磁氫譜和碳譜；取bCD-Lu粉末適量，設(shè)定分辨率16cm-1，掃描次數(shù)4次，測試范圍650-4000cm-1掃描紅外光譜；將bCD-

6、Lu溶于1M Na2CO3溶液，加入H2O2后200-800nm掃描化學發(fā)光光譜；將bCD-Lu分別溶于1M Na2CO3溶液和DMSO中，掃描紫外光譜。bCD-Lu溶解于1M Na2CO3溶液反應(yīng)2h，丙酮沉淀后，溶于DMSO-d6，掃描核磁氫譜。
　　3.bCD-Lu納米粒（bCD-Lu NP）的制備和表征
　　將bCD-Lu50.0mg，加入2mL DMF攪拌溶解，緩慢加入10mL蒸餾水，室溫下攪拌2h后，12000r

7、pm離心10min，棄去上清，加入2mL蒸餾水水洗3次后得bCD-Lu NP。少量水分散后，采用透射電子顯微鏡觀察納米粒形態(tài)，并測定其粒徑和電位。
　　4.bCD-Lu NP在不同pH和不同濃度H2O2溶液中的穩(wěn)定性
　　取bCD-Lu NP溶液加入pH1.0～14的水解介質(zhì)中，500nm處測定溶液的透光率，并收集相應(yīng)時間點的水解數(shù)據(jù)。另取納米粒溶液加入含有1～800mM H2O2的水解介質(zhì)中，測定不同時間點500nm處的透

8、光率。
　　5.H2O2濃度對bCD-Lu NP化學發(fā)光光譜和強度的影響
　　在石英比色皿中加入bCD-Lu NP和魯米諾鈉鹽（luminol-Na）后，加入0～100mM不同濃度的H2O2，掃描bCD-Lu NP化學發(fā)光光譜。在透明光學玻璃樣品池中加入bCD-Lu NP和luminol-Na，加入0～10mM H2O2，微弱發(fā)光測量儀測定發(fā)光強度-時間變化曲線。
　　6.MPO和Cl-水平對bCD-Lu NP化學發(fā)光

9、光譜和強度的影響
　　在石英比色皿中和玻璃樣品池中加入bCD-Lu NP和luminol-Na后，按照方案PBS+H2O2，PBS+MPO+H2O2和MPO+NaCl+H2O2加入MPO、Cl-，隨后加入H2O2觀察納米粒的化學發(fā)光光譜變化并記錄強度-時間變化曲線。以同樣的方法測定NaClO對bCD-Lu NP發(fā)光行為的影響，其中NaClO的濃度在0～1mM之間。
　　7.bCD-Lu NP濃度對其化學發(fā)光光譜和強度的影響<

10、br>　　將0～6mg/mL的bCD-Lu NP樣品加入等體積的1mM H2O2后觀察納米粒的化學發(fā)光光譜變化；移取0～10mg/mL的bCD-Lu NP溶液于樣品池中，加入等體積的10mM H2O2，測定納米粒發(fā)光強度變化。
　　8.MPO抑制劑和活性氧清除劑對bCD-Lu NP發(fā)光強度的影響
　　在樣品池中加入bCD-Lu NP后，加入等體積MPO和1～10μM MPO抑制劑對氨基苯甲酰肼（4-Aminobenzoic

11、acid hydrazide，4-ABAH）或0～1000μM活性氧清除劑哌啶醇氧化物（4-Hydroxy-TEMPO，TEMPOL），隨后，加入等體積的10mM H2O2測定bCD-Lu NP發(fā)光強度的變化。
　　9.孔板成像考察H2O2對bCD-Lu NP發(fā)光特性的影響
　　吸取bCD-Lu NP溶液于黑色96孔板中，分別加入0～1mM H2O2樣品溶液，共12孔，隨后，以IVIS成像系統(tǒng)測定化學發(fā)光強度，其中曝光時間為

12、5min。
　　10.孔板成像考察MPO、Cl-及bCD-Lu NP濃度對其發(fā)光行為的影響
　　在黑色96孔板中加入bCD-Lu NP，將0～100mU/mL的MPO溶液或0～200mM NaCl+200mU/mL MPO溶液移入孔板，隨后，加入200μM H2O2以相同條件進行IVIS成像。吸取0～10mg/mL bCD-Lu NP溶液于黑色96孔板中，加入1mM H2O2后立即成像。
　　11.孔板成像研究MPO抑

13、制劑和活性氧清除劑對bCD-Lu NP發(fā)光的影響
　　在黑色96孔板中加入bCD-Lu NP后，加入等體積MPO和0～10.24μM4-ABAH或0～40μM TEMPOL，隨后，加入等體積200μM H2O2記錄bCD-Lu NP發(fā)光強度值。
　　12.bCD-Lu NP在中性粒細胞中的發(fā)光行為研究
　　Balb/c小鼠腹腔注射3％巰基乙酸鹽溶液，4h后處死小鼠，腹腔注射HBSS，5min后，抽取腹腔灌洗液，離心棄上

14、清，HBSS清洗2次，重懸獲得中性粒細胞。12孔板每孔接種5.0×105細胞，加入佛波酯刺激，1h后，分別加入bCD-Lu NP和luminol-Na成像，通過IVIS系統(tǒng)成像。
　　13.bCD-Lu NP在足趾腫脹模型中的成像功能評價
　　取Balb/c小鼠，于左后側(cè)足趾部位局部注射0.2%角叉菜膠溶液建立模型，造模6h后，分別局部注射bCD-Lu NP和lumiol-Na（含量按luminol單元計算為0.75mg/k

15、g），并采用IVIS進行成像。隨后，以地塞米松（Dexamethasone,DEX）干預模型，再次觀察納米粒的成像效果。
　　14.bCD-Lu NP在腹膜炎模型中的成像效果研究
　　取Balb/c小鼠腹腔注射0.1%脂多糖建立模型，6h后，腹腔注射bCD-Lu NP和lumiol-Na（含量按luminol計算為7.5mg/kg），并進行IVIS成像。此外，Balb/c小鼠腹腔注射0.1%脂多糖，3%巰基乙酸鹽或0.1%酵

16、母多糖溶液建立腹膜炎模型。6h后，注射0.5mL bCD-Lu NP（按luminol單元劑量為7.5mg/kg），進行IVIS成像，并測定小鼠腹腔灌洗液中中性粒細胞的比例。以0.1%酵母多糖為刺激物建立腹膜炎模型，測定模型小鼠腹腔灌洗液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）白介素-1β（IL-1β）的水平。隨后給予bCD-Lu NP，觀察發(fā)光強度隨時間的變化；同時測定腹腔灌洗液中中性粒細胞比例、MPO和活性氧（ROS）含量。此后，分別在成像

17、前注射500μM4-ABAH和12.8μM TEMPOL，考察抑制劑對發(fā)光強度的影響。
　　15.bCD-Lu NP在急性肺損傷模型中的發(fā)光行為研究
　　取Balb/c小鼠通過鼻腔呼吸道吸入0.1%脂多糖溶液建立急性肺損傷模型，6h后，尾靜脈注射bCD-Lu NP和lumiol-Na（含量按luminol計算為3mg/kg），進行IVIS成像。并取PBS肺部灌洗液和肺組織測定MPO、ROS、TNF-α和IL-1β的含量。隨后

18、，建立0～24 h不同時間點肺損傷模型，給予bCD-Lu NP（含量按luminol計算為3mg/kg），考察發(fā)光強度和炎癥進程的關(guān)系，同時測定肺組織中性粒細胞比例以及MPO和ROS含量。
　　16.bCD-Lu NP在結(jié)腸炎模型中的成像效果評價
　　取C57BL/6J小鼠給予3%葡聚糖硫酸酯鈉鹽（DSS）水溶液建立結(jié)腸炎模型，于模型建立第1,3,7天后，直腸給予bCD-Lu NP進行IVIS成像，并同時測定結(jié)腸部位MPO和

19、ROS含量。
　　17.載DEX的bCD-Lu NP對小鼠足趾腫脹治療作用的評價
　　制備負載DEX的bCD-Lu納米粒（DEX/bCD-Lu NP），同時選擇聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為對照材料制備負載DEX的納米粒（DEX/PLGA NP），對其進行表征。取Balb/c小鼠，測厚儀測量小鼠足趾部位厚度，于左后側(cè)足趾部位局部注射0.2%角叉菜膠溶液建立模型。造模0.5h后，給予DEX/bCD-Lu NP和DEX/P

20、LGA NP（按DEX劑量為2.5mg/kg）。6h后，測量小鼠足趾厚度，同時收集成像圖片。此后，小鼠足趾部位給予50μL luminol-Na溶液，再次進行成像。
　　18.DEX/bCD-Lu NP對小鼠腹膜炎治療作用的評價
　　取Balb/c小鼠腹腔注射0.1%酵母多糖建立模型，0.5h后，腹腔注射給予DEX/bCD-Lu NP和DEX/PLGA NP（按DEX劑量計算為2.5mg/kg）進行干預。6h后，取腹腔灌洗液

21、測定其中中性粒細胞比例以及MPO、ROS、TNF-α和IL-1β的水平。
　　19.DEX/bCD-Lu NP對小鼠急性肺損傷治療作用的研究
　　取Balb/c小鼠，通過鼻腔呼吸道吸入0.1%脂多糖溶液建立急性肺損傷模型，0.5h后，尾靜脈注射DEX/bCD-Lu NP和DEX/PLGA NP（按DEX劑量計算為2.5mg/kg）進行干預。12h后，取肺組織灌洗液測定其中中性粒細胞比例以及MPO、ROS、TNF-α和IL-1

22、β含量。同時測定肺組織中炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達水平。
　　20.bCD-Lu NP對小鼠動脈粥樣硬化的治療作用評價
　　取載脂蛋白E缺陷（ApoE-/-）小鼠，喂養(yǎng)高脂飼料（5%豬油和0.25%膽固醇）建立動脈粥樣硬化模型，1月后，腹腔注射給予Cy7.5標記的bCD-Lu納米粒（Cy7.5/bCD-Lu NP），給藥12天后處死小鼠，剝離主動脈進行IVIS成像觀察納米粒在主動脈斑塊部位的富集情況。治療實驗中，給

23、予高脂飲食1月后，腹腔注射給予生理鹽水和bCD-Lu NP（30mg/kg）直至實驗結(jié)束，每隔3天給藥一次，記錄小鼠體重變化。3個月后，取小鼠全血和血清測定血常規(guī)、血脂和肝腎功能指標，同時測定小鼠血清炎癥因子。取小鼠主動脈至腹主動脈分叉段，0.3%油紅O染色，尼康Nis-Elements BR3.2軟件統(tǒng)計斑塊面積。此外，以組織消化液消化主動脈，加入V450抗CD11b和PE抗Ly6G小鼠抗體，流式細胞儀測定主動脈組織中中性粒細胞含量。

24、另外，取主動脈根部冰凍切片，進行Masson染色，并與α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和CD68抗體分別進行孵育染色，以軟件統(tǒng)計相應(yīng)面積。
　　21.bCD-Lu NP的細胞毒性評價
　　于96孔板中每孔加入1×105巨噬細胞RAW264.7或乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞，加入濃度為3.9～1μg/mL的bCD-Lu NP溶液。孵育24h后，加入培養(yǎng)基90μL和MTT10μL，酶標儀490nm除測定吸光度值，計算細胞存

25、活率。
　　22.bCD-Lu NP的初步體內(nèi)安全性評價
　　昆明小鼠稱重后，尾靜脈注射給予600mg/kg bCD-Lu NP。注射后，每2天記錄體重，觀察其基本生命體征。15天后，小鼠處死后取血樣測定血常規(guī)，并取血清，測定谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和尿素肝腎功指標。并取小鼠主要臟器，計算臟器指數(shù)，同時進行組織病理學分析。
　　結(jié)果:
　　1.基于β-CD和luminol合成了功能材料bCD-Lu，并對材料進

26、行了紅光光譜、核磁氫譜和碳譜表征，其水解產(chǎn)物核磁氫譜顯示β-CD與luminol的摩爾比為1:1。與luminol化學發(fā)光光譜和紫外光譜相比，材料的最大發(fā)射峰和吸收峰沒有發(fā)生位移。
　　2.通過納米沉淀法制備了發(fā)光納米粒bCD-Lu NP，其粒徑為220nm，Zeta電位為-25mV。
　　3.bCD-Lu NP在pH＜2或＞9.2溶液中能夠快速分解，伴隨H2O2濃度的增高，其水解逐漸加快。當H2O2濃度提高至50mM時，納

27、米?？焖偎?，1.5h后，溶液透光率即提高至23%。
　　4.與luminol-Na相比，bCD-Lu NP在H2O2溶液中的化學發(fā)光光譜未發(fā)生變化，最大發(fā)射峰位置與luminol-Na一致；而在相同條件下，bCD-Lu NP的發(fā)光強度和持續(xù)時間均顯著增加；隨雙氧水濃度的提高，bCD-Lu NP的發(fā)光強度具有H2O2響應(yīng)性，與H2O2濃度成正相關(guān)。
　　5.bCD-Lu NP溶液的光譜學研究和孔板成像結(jié)果顯示，逐一加入MPO

28、和Cl-后，發(fā)光強度逐步升高，并具有突躍性，強度升高程度和MPO以及Cl-濃度成依賴性，最大發(fā)射峰位置未發(fā)生改變。納米粒溶液在加入NaClO溶液后，發(fā)光強度升高，強度與NaClO濃度呈正相關(guān)。
　　6.bCD-Lu NP溶液的化學發(fā)光強度變化呈現(xiàn)濃度依賴性，納米粒濃度升高，發(fā)光強度逐漸增大，最大發(fā)射峰位置不變。
　　7.bCD-Lu NP溶液的發(fā)光強度在加入MPO抑制劑4-ABAH和ROS清除劑TEMPOL后，受到顯著抑制，

29、表明其發(fā)光具有MPO和ROS響應(yīng)性。
　　8.bCD-Lu NP在小鼠足趾腫脹模型中具有良好的成像功能，與luminol相比，其成像具有緩慢增加，不斷增強的趨勢，具有顯著延長的小鼠體內(nèi)成像時間；而在DEX干預后，成像效果受到明顯抑制，說明納米粒的成像與炎癥的程度息息相關(guān)。
　　9.bCD-Lu NP在腹膜炎模型中的成像效果良好，其發(fā)光時間延長的結(jié)果與足趾腫脹模型一致。在脂多糖、巰基乙酸鹽和酵母多糖三種刺激物誘導的小鼠腹膜炎模

30、型中，納米粒的發(fā)光與腹腔灌洗液中的中性粒細胞數(shù)呈顯著正相關(guān)，R值為0.99。酵母多糖誘導的小鼠腹膜炎中，成像時間點考察結(jié)果與腹腔灌洗液中中性粒細胞比例及MPO、ROS含量呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性；而在加入抑制劑4-ABAH和TEMPO后，動物體內(nèi)發(fā)光受到抑制，亦證明bCD-Lu NP的體內(nèi)發(fā)光具有MPO和ROS依賴性和響應(yīng)性。
　　10.在小鼠急性肺損傷模型中，bCD-Lu NP成像表現(xiàn)出獨特的優(yōu)點，與其相比，luminol組均無明顯的發(fā)

31、光。通過在不同時間點對肺損傷小鼠進行在體成像，并測定肺組織中的中性粒細胞比例及MPO、ROS含量，結(jié)果顯示，發(fā)光強度與后者表現(xiàn)出依賴性和響應(yīng)性。
　　11.bCD-Lu NP在小鼠結(jié)腸炎模型中亦表現(xiàn)出一定的發(fā)光特性，強度相對較弱；但通過測定結(jié)腸部位MPO和ROS含量，亦發(fā)現(xiàn)，其發(fā)光強度和二者變化趨勢一致。
　　12.通過納米沉淀法制備了載藥納米粒DEX/bCD-Lu NP和DEX/PLGA NP，粒徑分別為240和190nm

32、，Zeta電位為-30和-36mV。在小鼠足趾腫脹模型中，通過測定小鼠足趾腫脹厚度及成像結(jié)果表明，DEX/bCD-Lu NP具有良好的治療效果，且證明了bCD-Lu NP同時具有成像和藥物遞送功能。
　　13.DEX/bCD-Lu NP能夠有效抑制小鼠腹膜炎的進展，在納米粒治療組，腹腔灌洗液中的中性粒細胞比例、MPO、ROS及炎癥因子TNF-α和IL-1β都有顯著性降低。
　　14.在小鼠急性肺損傷模型的治療研究中，DEX/

33、bCD-Lu NP也表現(xiàn)出良好的治療效果。通過測定肺灌洗液中的中性粒細胞比例、MPO、ROS及炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量，以及肺組織中TNF-α和IL-1β的水平，結(jié)果均表明，上述細胞和因子都有顯著性降低。
　　15.在基于ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型的治療研究中，主動脈油紅染色結(jié)果表明，在納米粒干預組，斑塊面積有所減少，和對照組相比，有顯著性差異。中性粒細胞流式分析以及冰凍切片免疫組化染色結(jié)果表明，在納米粒干預組

34、，中性粒細胞數(shù)和MPO水平均有所減少。冰凍切片巨噬細胞和斑塊膠原染色統(tǒng)計結(jié)果表明納米粒能夠有效提高斑塊的穩(wěn)定性。上述結(jié)果說明bCD-Lu NP對動脈粥樣硬化具有較好的治療效果。
　　16.初步bCD-Lu NP的細胞毒性和小鼠急性毒性試驗結(jié)果顯示，bCD-Lu NP具有良好的體內(nèi)外安全性。在600mg/kg劑量下，動物體重、臟器指數(shù)、血常規(guī)及肝腎功等指標與對照組相比，無顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1.成功合成了髓過氧

35、化物酶響應(yīng)性化學發(fā)光材料bCD-Lu，并制備了相應(yīng)的納米粒；共價鍵結(jié)合后，bCD-Lu的發(fā)光行為未發(fā)生變化，H2O2、MPO和Cl-能顯著提高納米粒的化學發(fā)光強度；MPO抑制劑和ROS清除劑能顯著抑制bCD-Lu NP的發(fā)光強度，故納米粒的發(fā)光特性具有明顯的MPO和ROS響應(yīng)性。與luminol相比，bCD-Lu NP具有顯著增強的發(fā)光強度和明顯延長的發(fā)光時間。
　　2.bCD-Lu NP能夠在小鼠足趾腫脹模型中進行在體成像，且發(fā)

36、光強度能夠被DEX抑制，納米粒的發(fā)光強度可以反映炎癥的發(fā)展程度；bCD-Lu NP在小鼠腹膜炎、急性肺損傷和結(jié)腸炎模型中的發(fā)光強度與中性粒細胞數(shù)以及MPO和ROS的水平相關(guān)，具有MPO和ROS依賴性，故bCD-Lu NP的化學發(fā)光強度能夠反映炎癥初期的進展情況。
　　3.bCD-Lu NP能夠負載抗炎藥物DEX，DEX/bCD-Lu NP在小鼠足趾腫脹、腹膜炎和急性肺損傷模型中，呈現(xiàn)良好的治療效果，能顯著減少疾病部位中性粒細胞的浸

37、潤、降低MPO、ROS及炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平。
　　4.bCD-Lu NP通過降低主動脈斑塊部位中性粒細胞數(shù)，減少斑塊部位巨噬細胞數(shù)量，增加膠原含量，可以有效減小動脈粥樣硬化斑塊面積、并提高斑塊穩(wěn)定性。
　　5.初步體內(nèi)外評價表明bCD-Lu NP具有良好的安全性。
　　綜上所述，本論文基于β-CD和發(fā)光物質(zhì)luminol合成了功能性載體材料bCD-Lu，并以其構(gòu)建了MPO和ROS響應(yīng)性的發(fā)光納米載體。