基于家蠶-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備人髓過氧化物酶的研究.pdf

1、髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）是一種存在于正常人多形核中性白細(xì)胞（Polymorphonuclear neutrophils，PMN）嗜苯胺藍(lán)顆粒（Azurophilic granules）中被糖基化的血紅素包含形可溶酶，它通過催化形成強(qiáng)氧化物和次氯酸在自身免疫有氧殺滅微生物系統(tǒng)中扮演著重要角色。針對(duì)自身免疫系統(tǒng)性血管炎和炎癥性等疾病，利用抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（p-ANCA）進(jìn)行診斷已成為既定工具。臨床上常見的自

2、身抗原是人 MPO及蛋白酶3（PR3），通過抗原特異性診斷設(shè)備檢測(cè)與這些抗原相對(duì)應(yīng)的來自于中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒的自身抗體，能夠很容易地診斷出與抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)的疾病。作為p-ANCA免疫熒光圖譜的主要標(biāo)靶，人MPO自身抗體指出了某些疾病的程度，如：特發(fā)性新月體性腎小球腎炎， Churg-Strauss綜合征，以及經(jīng)典型結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎等相關(guān)疾病。
　　臨床上用于自身免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病體外診斷的MPO以人源天然蛋白為最佳，但天然

3、蛋白的資源有限，來源各異，導(dǎo)致純化的天然抗原純度低、批次之間不一致，且成本昂貴。由于表達(dá)和蛋白折疊技術(shù)的瓶頸限制，利用體外表達(dá)系統(tǒng)所獲得的重組人MPO成本高昂，這些條件嚴(yán)重制約了自身免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病體外診斷技術(shù)的發(fā)展。
　　本研究通過將完整的人髓過氧化物酶MPO的cDNA克隆到帶有6個(gè)組氨酸的供體質(zhì)粒上，獲得含人MPO基因的重組供體質(zhì)粒；在大腸桿菌BmDH10Bac中和家蠶桿狀病毒基因組桿粒（Bacmid）于轉(zhuǎn)座子（Tn7）上發(fā)生

4、轉(zhuǎn)座，通過藍(lán)白斑篩選出帶有目的基因的克?。浑S后在家蠶BmN細(xì)胞中制備含人MPO基因的重組病毒；以制備的重組病毒感染宿主昆蟲家蠶（Bombyx mori），同時(shí)給家蠶添食一定量的血紅素前體；收集含表達(dá)了人MPO的家蠶幼蟲的體液，在裂解緩沖液存在下經(jīng)超聲波裂解，4℃下進(jìn)行高速離心，收集的上清應(yīng)用鎳-柱親和層析結(jié)合離子交換層析的方法進(jìn)行分離純化，最終獲得目的產(chǎn)物人髓過氧化物酶。分析結(jié)果表明，重組人 MPO能夠在家蠶體內(nèi)得到很好的表達(dá)和包裝，蛋

5、白質(zhì)翻譯后的（糖基化）修飾良好，分離純化后的蛋白比活性達(dá)396.7±41.7 milliunits/mg，且能夠被病人陽性血清所識(shí)別。
　　利用家蠶-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在五齡家蠶中制備的人重組 MPO具與來源于人嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)的MPO相當(dāng)?shù)谋然钚裕磺冶磉_(dá)量高：平均每條蠶可制備高達(dá)1.7微克左右目的蛋白；成本低：由于避免了AcMNPV桿狀病毒－Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)中昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)所需昂貴的培養(yǎng)基和胎牛血清，且家蠶飼養(yǎng)簡(jiǎn)單方便。