基于家蠶-桿狀病毒表達系統(tǒng)制備人髓過氧化物酶的研究.pdf

1、髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）是一種存在于正常人多形核中性白細胞（Polymorphonuclear neutrophils，PMN）嗜苯胺藍顆粒（Azurophilic granules）中被糖基化的血紅素包含形可溶酶，它通過催化形成強氧化物和次氯酸在自身免疫有氧殺滅微生物系統(tǒng)中扮演著重要角色。針對自身免疫系統(tǒng)性血管炎和炎癥性等疾病，利用抗中性粒細胞胞漿抗體（p-ANCA）進行診斷已成為既定工具。臨床上常見的自

2、身抗原是人 MPO及蛋白酶3（PR3），通過抗原特異性診斷設備檢測與這些抗原相對應的來自于中性粒細胞嗜天青顆粒的自身抗體，能夠很容易地診斷出與抗中性粒細胞胞漿抗體相關的疾病。作為p-ANCA免疫熒光圖譜的主要標靶，人MPO自身抗體指出了某些疾病的程度，如：特發(fā)性新月體性腎小球腎炎， Churg-Strauss綜合征，以及經(jīng)典型結節(jié)性多動脈炎等相關疾病。
　　臨床上用于自身免疫系統(tǒng)相關疾病體外診斷的MPO以人源天然蛋白為最佳，但天然

3、蛋白的資源有限，來源各異，導致純化的天然抗原純度低、批次之間不一致，且成本昂貴。由于表達和蛋白折疊技術的瓶頸限制，利用體外表達系統(tǒng)所獲得的重組人MPO成本高昂，這些條件嚴重制約了自身免疫系統(tǒng)相關疾病體外診斷技術的發(fā)展。
　　本研究通過將完整的人髓過氧化物酶MPO的cDNA克隆到帶有6個組氨酸的供體質(zhì)粒上，獲得含人MPO基因的重組供體質(zhì)粒；在大腸桿菌BmDH10Bac中和家蠶桿狀病毒基因組桿粒（Bacmid）于轉座子（Tn7）上發(fā)生

4、轉座，通過藍白斑篩選出帶有目的基因的克??；隨后在家蠶BmN細胞中制備含人MPO基因的重組病毒；以制備的重組病毒感染宿主昆蟲家蠶（Bombyx mori），同時給家蠶添食一定量的血紅素前體；收集含表達了人MPO的家蠶幼蟲的體液，在裂解緩沖液存在下經(jīng)超聲波裂解，4℃下進行高速離心，收集的上清應用鎳-柱親和層析結合離子交換層析的方法進行分離純化，最終獲得目的產(chǎn)物人髓過氧化物酶。分析結果表明，重組人 MPO能夠在家蠶體內(nèi)得到很好的表達和包裝，蛋

5、白質(zhì)翻譯后的（糖基化）修飾良好，分離純化后的蛋白比活性達396.7±41.7 milliunits/mg，且能夠被病人陽性血清所識別。
　　利用家蠶-桿狀病毒表達系統(tǒng)在五齡家蠶中制備的人重組 MPO具與來源于人嗜中性粒細胞表達的MPO相當?shù)谋然钚?；且表達量高：平均每條蠶可制備高達1.7微克左右目的蛋白；成本低：由于避免了AcMNPV桿狀病毒－Bac-to-Bac表達系統(tǒng)中昆蟲細胞培養(yǎng)所需昂貴的培養(yǎng)基和胎牛血清，且家蠶飼養(yǎng)簡單方便。