脾臟介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)參與小鼠心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分內(nèi)容：脾臟在小鼠急性心肌缺血再灌注損傷機(jī)制中的作用
　　研究目的：免疫炎癥反應(yīng)在急性心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，脾臟參與心肌梗死后損傷修復(fù)及心室重塑過(guò)程，但其是否參與急性心肌缺血再灌注損傷目前并不清楚。本部分研究?jī)?nèi)容擬在小鼠在體心肌缺血再灌注損傷模型中探討脾臟是否在急性心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用。
　　研究?jī)?nèi)容及方法：利用C57BL6野生型（WT）小鼠分別進(jìn)行10分鐘、20分鐘、30分鐘、4

2、0分鐘或50分鐘心肌缺血結(jié)合60分鐘再灌注以構(gòu)建在體心肌缺血再灌注損傷模型。各缺血時(shí)間小鼠分為脾切除組及脾切除假手術(shù)組。急性脾切除處理組小鼠在心肌缺血前30分鐘切除脾臟。將脾臟分離成脾免疫細(xì)胞單細(xì)胞懸液，使用臺(tái)盼藍(lán)染色法判定脾免疫細(xì)胞活性。將5×106活脾免疫細(xì)胞靜脈注入脾切除小鼠以重建脾免疫細(xì)胞。分別在20分鐘及40分鐘心肌缺血組小鼠建立脾切除后脾免疫細(xì)胞重建模型。TTC&藍(lán)雙染色法檢測(cè)心肌梗死面積。
　　研究結(jié)果：TTC染色結(jié)

3、果顯示：脾切除顯著減小40分鐘（對(duì)照49.6±1.4％ vs脾切除35.7±1.9%，p<0.05）及50分鐘（對(duì)照：56.4±1.3% vs脾切除：42.6±1.9%, p<0.05）心肌缺血組小鼠再灌注后心肌梗死面積，而對(duì)10分鐘（對(duì)照：0.54±0.36% vs脾切除0.62±0.38%, p=NS）、20分鐘（對(duì)照：7.25±1.3% vs脾切除：7.0±1.6%，p=NS）及30分鐘（對(duì)照：34.85±3.2% vs脾切除：2

4、9.4±5.2%，p=NS）缺血組再灌注后心肌梗死面積無(wú)顯著影響。重建脾切除小鼠的脾免疫細(xì)胞后可以顯著增加40分鐘心肌缺血組小鼠再灌注后心肌梗死面積（脾切除：35.7±1.9% vs脾切除+脾細(xì)胞重建50.8±0.9%，p<0.05），而對(duì)20分鐘組心肌缺血組小鼠心肌梗死面積無(wú)顯著影響（脾切除：7.25±1.3% vs脾細(xì)胞重建：7.6±0.9%，p=NS）。
　　結(jié)論：脾臟在較嚴(yán)重（小鼠模型中缺血時(shí)間≥40分鐘）心肌缺血再灌注損

5、傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分內(nèi)容：HMGB1-RAGE通路構(gòu)成心臟-脾軸參與心肌缺血再灌注損傷過(guò)程，增加再灌注后心肌梗死面積
　　研究目的：組織損傷后可以釋放“危險(xiǎn)信號(hào)相關(guān)分子”，其中HMGB1被證實(shí)在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中具有重要作用。其可以通過(guò)與RAGE受體結(jié)合激活免疫炎癥反應(yīng)促進(jìn)組織損傷。在第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上我們提出假設(shè)：較長(zhǎng)時(shí)間心肌缺血將導(dǎo)致心肌組織釋放更多HMGB1并通過(guò)RAGE受體激活脾臟免疫細(xì)胞

6、，從而加重心肌再灌注損傷。本部分內(nèi)容擬在小鼠心肌缺血再灌注損傷模型中進(jìn)一步證實(shí)上述假設(shè)。
　　研究?jī)?nèi)容及方法：使用C57BL6小鼠及RAGE基因敲除（Knockout，KO）小鼠建立心肌缺血再灌注損傷模型，所有小鼠再灌注時(shí)間均為60分鐘。根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選取20分鐘心肌缺血組小鼠作為低損傷對(duì)照進(jìn)行本部分研究。急性脾切除處理組小鼠在心肌缺血前30分鐘切除脾臟。將脾臟分離成脾免疫細(xì)胞單細(xì)胞懸液，使用臺(tái)盼藍(lán)染色法判定脾免疫細(xì)胞

7、活性。將5×106活脾免疫細(xì)胞靜脈注入脾切除小鼠以重建脾免疫細(xì)胞。部分小鼠于心肌缺血后10分鐘或40分鐘時(shí)取心肌標(biāo)本獲得缺血心肌組織勻漿（Ischemichearthomogenate, IHH）。BCA蛋白濃度測(cè)定法用于檢測(cè)缺血心肌組織勻漿濃度。缺血心肌組織勻漿處理組小鼠于再灌注前5分鐘靜脈注射10μg/g缺血心肌組織勻漿。TTC&藍(lán)雙染色法檢測(cè)心肌梗死面積。免疫沉淀法用于分離缺血心肌組織勻漿中的HMGB1蛋白。Western-Blo

8、t法檢測(cè)HMGB1表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：與對(duì)照組及10-IHH處理組相比，40-IHH顯著增加20分鐘心肌缺血小鼠再灌注損傷后心肌梗死面積（10-IHH：9.9±1.5% vs40-IHH：33.3±2.5%， p<0.05）。40分鐘心肌缺血后心肌組織勻漿中 HMGB1表達(dá)水平均顯著高于20分鐘缺血心肌組織。而使用免疫沉淀技術(shù)分離勻漿組織中HMGB1蛋白可以消除40-IHH增加心肌梗死面積作用（40-IHHHMGB1+：30

9、.1±2.37% vs40-IHHHMGB1-：10.1±3.4%，p<0.05）。40-IHH對(duì) RAGEKO小鼠心肌梗死面積無(wú)顯著影響（對(duì)照：7.6±1.0% vs40-IHH：8.4±1.3%，p=NS）。急性脾切除可以阻斷40-IHH增加心肌梗死面積作用（40-IHH：33.3±2.5% vs脾切除+40-IHH：9.8±1.7%， p<0.05）。利用野生型小鼠作為供體重建脾切除小鼠的脾免疫細(xì)胞后可恢復(fù)40-IHH加重心肌梗死

10、作用（脾切除+40-IHH：9.8±1.7% vs脾切除+脾細(xì)胞重建+40-IHH：32.6±2.2%，p<0.05），而40-IHH對(duì)使用 RAGEKO脾免疫細(xì)胞重建的的脾切除小鼠心肌梗死面積無(wú)顯著影響（脾切除+RAGEKO脾細(xì)胞重建：7.4±1.1% vs脾切除+RAGEKO脾細(xì)胞重建+40-IHH：7.8±1.5%，p=NS）。
　　結(jié)論：缺血心肌組織釋放HMGB1，后者作用于脾免疫細(xì)胞RAGE受體構(gòu)成心臟-脾軸，參與心肌缺

11、血再灌注損傷。
　　第三部分內(nèi)容：心臟-脾軸通過(guò)介導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化、浸潤(rùn)，增加心肌梗死面積
　　研究目的：中性粒細(xì)胞是急性心肌缺血再灌注損傷的主要參與者，被認(rèn)為是免疫損傷的最終執(zhí)行者。然而近來(lái)有研究報(bào)道,肝臟再灌注損傷后 HMGB1/RAGE通路可以通過(guò)活化中性粒細(xì)胞并增強(qiáng)其趨化活性,誘導(dǎo)損傷部位大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),加重組織損傷。但脾臟在組織損傷后中性粒細(xì)胞活化過(guò)程中的作用仍不清楚。通過(guò)之前的研究?jī)?nèi)容我們已經(jīng)證實(shí),缺血心肌組

12、織中 HMGB1通過(guò)脾細(xì)胞RAGE受體參與心肌缺血再灌注損傷。本部分研究主要探討心臟(HMGB1)-脾(RAGE受體)軸對(duì)心肌缺血再灌注損傷后中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的影響,并初步探索可能的治療策略。
　　研究?jī)?nèi)容及方法：使用C57BL6小鼠建立心肌缺血再灌注損傷模型，進(jìn)行20分鐘與40分鐘心肌缺血合并60分鐘再灌注。急性脾切除處理組小鼠在心肌缺血前30分鐘切除脾臟。部分小鼠于心肌缺血后10分鐘或40分鐘時(shí)取心肌標(biāo)本獲得缺血心肌組織勻漿（I

13、schemic myocardial homogenate,IHH）。BCA蛋白濃度測(cè)定法用于檢測(cè)缺血心肌組織勻漿濃度。缺血心肌組織勻漿處理組小鼠于再灌注前5分鐘靜脈注射10μg/g缺血心肌組織勻漿。cFLFLF處理組小鼠于再灌注前5分鐘靜脈注射FPR1受體特異性阻斷劑cFLFLF（500μg/kg）。HemaVet系統(tǒng)檢測(cè)外周血中性粒細(xì)胞水平，免疫熒光及共聚焦顯微鏡檢測(cè)脾及心肌組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平、FPR1表達(dá)及定位共表達(dá)情況。TT

14、C&藍(lán)雙染色法檢測(cè)心肌梗死面積。
　　研究結(jié)果：HemaVet檢測(cè)結(jié)果顯示，40分鐘缺血小鼠再灌注時(shí)外周血中性粒細(xì)胞水平顯著高于假手術(shù)組及20分鐘缺血組；脾切除顯著減少40分鐘缺血組小鼠再灌注期外周血中性粒細(xì)胞水平；在20分鐘缺血小鼠中，40-IHH顯著增加再灌注時(shí)外周血中性粒細(xì)胞水平；而脾切除可以顯著抑制40-IHH上調(diào)外周血中性粒細(xì)胞作用。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與20分鐘心肌缺血小鼠相比40-IHH處理組或40分鐘心肌缺血組再

15、灌注后心肌組織中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著升高。脾切除可以顯著降低40分鐘缺血小鼠心肌組織中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平。免疫熒光顯示，40-IHH顯著增加脾臟組織中免疫細(xì)胞 FPR1受體表達(dá)水平；共聚焦顯微鏡觀察到增加的 FPR1蛋白表達(dá)主要定位于中性粒細(xì)胞。cFLFLF處理組顯著減少循環(huán)血及心肌組織中中性粒細(xì)胞水平，同時(shí)減輕40-IHH處理組心肌缺血再灌注損傷，減小心肌梗死面積。
　　結(jié)論：心臟-脾軸介導(dǎo)了心肌缺血再灌注損傷后中性粒細(xì)胞活化

16、及心肌浸潤(rùn)，從而加重再灌注心肌損傷。FPR1可以作為治療靶點(diǎn)抑制心臟-脾軸介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞活化，減輕心肌缺血再灌注損傷。
　　第四部分內(nèi)容：急性高血糖通過(guò)激活脾免疫炎癥細(xì)胞增加缺血再灌注損傷后心肌梗死面積
　　研究目的：急性高血糖顯著增加非糖尿病患者急性心肌梗死及心臟手術(shù)患者死亡率，影響心臟功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)急性高血糖可以顯著增加再灌注損傷后心肌梗死面積，但其詳細(xì)作用機(jī)制仍不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，急性高血糖可以顯著激活免疫

17、炎癥細(xì)胞活性，促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)。前三部分內(nèi)容我們已經(jīng)證實(shí)脾臟在心肌缺血再灌注免疫損傷機(jī)制中的核心地位，在此基礎(chǔ)上我們提出假設(shè)：急性高血糖可能通過(guò)激活脾免疫炎癥細(xì)胞，促進(jìn)再灌注階段免疫炎癥反應(yīng)，加重心肌缺血再灌注損傷。本部分研究?jī)?nèi)容將在在體小鼠心肌缺血再灌注損傷模型中對(duì)這一假設(shè)加以驗(yàn)證。
　　研究?jī)?nèi)容及方法：使用C57BL6小鼠建立心肌缺血再灌注損傷模型。第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，30分鐘心肌缺血小鼠再灌注后形成顯著心肌梗死，而脾切除對(duì)

18、30分鐘缺血小鼠再灌注損傷無(wú)顯著影響。因此選取30分鐘心肌缺血組小鼠作為本部分研究對(duì)象。急性高血糖處理組于心肌缺血前20分鐘腹腔注射20%高糖（2ml/kg）。急性脾切除處理組小鼠在心肌缺血前30分鐘切除脾臟。將脾臟分離成脾免疫細(xì)胞單細(xì)胞懸液，使用臺(tái)盼藍(lán)染色法判定脾免疫細(xì)胞活性。將5×106活脾免疫細(xì)胞靜脈注入脾切除小鼠以重建脾免疫細(xì)胞。cFLFLF處理組小鼠于缺血前靜脈注射特異性FPR1受體阻斷劑cFLFLF（500μg/kg）。He

19、maVet系統(tǒng)檢測(cè)外周血中性粒細(xì)胞水平。相應(yīng)處理組取小鼠脾臟吸取表面液體后稱重，免疫熒光檢測(cè)小鼠脾臟及心臟中免疫細(xì)胞及FPR1水平。DHE探針檢測(cè)小鼠脾臟及心臟活性氧簇水平。TTC&藍(lán)雙染色法檢測(cè)心肌梗死面積。
　　研究結(jié)果：急性高血糖顯著增加30分鐘心肌缺血小鼠再灌注后心肌梗死面積。脾切除可以顯著阻斷急性高血糖上述增加心肌梗死面積的作用。脾免疫細(xì)胞重建可以恢復(fù)急性高血糖增加心肌梗死面積作用。急性高血糖顯著增加再灌注階段外周血中性

20、粒細(xì)胞水平，同樣這一作用在脾切除小鼠模型中顯著消失。急性高血糖小鼠再灌注后脾重量顯著減輕，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)再灌注階段高血糖組小鼠脾臟白髓邊緣區(qū)中性粒細(xì)胞水平顯著降低伴隨著脾臟重量減低。急性高血糖組小鼠再灌注階段心肌組織中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加。在無(wú)損傷小鼠中，急性高血糖顯著增加脾免疫細(xì)胞活性氧簇水平，但對(duì)心肌組織中活性氧水平無(wú)顯著影響。使用FPR1特異性阻斷劑可以顯著減輕急性高血糖導(dǎo)致的心肌損傷。
　　結(jié)論：急性高血糖通過(guò)激活脾免