shRNA表達(dá)載體介導(dǎo)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1基因沉默對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：本研究以GSTP1作為基因治療靶點(diǎn)，運(yùn)用短發(fā)夾狀RNA介導(dǎo)RNA干擾沉默GSTP1基因觀察其對(duì)于雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株DU145的增殖活性，細(xì)胞周期和凋亡率的影響，并觀察轉(zhuǎn)染前后化療藥物敏感性的變化。
　　 目的：分析和比較GSTP1在激素難治型前列腺癌與早期局限性前列腺癌組織和血清中表達(dá)情況及其意義。
　　 方法：用免疫組化的方法檢測(cè)GSTP1在10例早期局限性前列腺癌組織，10例激素難治型前列腺癌組織

2、中的表達(dá)情況，取前列腺增生組織10例做對(duì)照。采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定方法檢測(cè)GSTP1在10例早期局限性前列腺癌患者，10例激素難治型前列腺癌患者血清中的表達(dá)情況，取前列腺增生患者10例做對(duì)照。
　　 結(jié)果：10例早期局限性前列腺癌組織中GSTP1蛋白的表達(dá)情況：陰性8例，弱陽(yáng)性1例，中等陽(yáng)性1例，陽(yáng)性率20％。10例激素難治型前列腺癌組織中GSTP1蛋白的表達(dá)情況：陰性2例，弱陽(yáng)性1例，中等陽(yáng)性4例，強(qiáng)陽(yáng)性3例，陽(yáng)性率80％。1

3、0例前列腺增生組織中GSTP1蛋白的表達(dá)情況：陰性0例，弱陽(yáng)性1例，中等陽(yáng)性2例，強(qiáng)陽(yáng)性7例，陽(yáng)性率100％。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)免疫組化結(jié)果示HRPC組織中GSTP1蛋白陽(yáng)性率高于PCa組織；而HRPC組織中GSTP1蛋白陽(yáng)性率低于BPH組織。10例早期局限性前列腺癌患者血清中GSTP1含量2033.39±232.75pg/mL,10例激素難治型前列腺癌患者血清中GSTP1含量3879.89±210.32pg/mL，兩組之間比較，

4、激素難治型組GSTP1含量高于早期局限性前列腺癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10例前列腺增生患者血清中GSTP1含量4019.07±170.33pg/mL，高于早期局限性前列腺癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。激素難治型組與前列腺增生組之間差異不顯著。
　　 結(jié)論：1.激素難治性前列腺癌組織中GSTP1蛋白表達(dá)高于早期局限性前列腺癌組織。
　　 2.激素難治性前列腺癌患者血清中GSTP1蛋白濃度高于早期局限性前列腺癌患者的

5、血清濃度。
　　 目的：DU145、PC3和LNCaP三種前列腺癌細(xì)胞株進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)其GSTP1基因mRNA含量和蛋白表達(dá)水平。
　　 方法：采用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞株DU145、PC3和LNCaP。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)三種前列腺癌細(xì)胞株中GSTP1基因mRNA含量，免疫印跡檢測(cè)三種前列腺癌細(xì)胞株中GSTP1蛋白含量。
　　 結(jié)果：半定量RT-PCR檢測(cè)三種細(xì)胞株中GSTP1基因mR

6、NA含量，結(jié)果以吸光度表示。
　　 結(jié)論：1、雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株DU145、PC3中GSTP1基因mRNA含量和蛋白表達(dá)水平均高于雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株LNCaP。
　　 2、DU145中GSTP1基因mRNA含量和蛋白表達(dá)水平高于PC3。GSTP1基因表達(dá)升高可能與激素非依賴性前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　 目的：設(shè)計(jì)特異性shRNA干擾序列轉(zhuǎn)染雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株DU145，誘導(dǎo)GSTP

7、1基因沉默，觀察其對(duì)DU145增殖活性和對(duì)化療藥物敏感性的影響。
　　 方法：通過(guò)軟件設(shè)計(jì)與參考相關(guān)文獻(xiàn)，選取靶序列形成shRNA的DNA模板并克隆到shRNA表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo載體中，獲得靶向抑制GSTP1基因表達(dá)的干涉質(zhì)粒。經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定。篩選出轉(zhuǎn)染率最高，基因沉默效果最好的表達(dá)載體介導(dǎo)shRNA用作RNA干擾。用脂質(zhì)體介導(dǎo)該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR、Western blotting方法檢測(cè)

8、GSTP1基因的mRNA、蛋白水平的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)RNA干擾的效果。觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性的變化，應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)初步評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染后對(duì)DU145細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響。比較RNA干擾前后DU145細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU、PA敏感性的變化，應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)初步評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染前后對(duì)不同濃度5-FU、PA對(duì)DU145細(xì)胞增殖活性的影響。
　　 結(jié)果：設(shè)計(jì)的三條表達(dá)載體和一條陰性對(duì)照載體：pGPU6/GFP/Neo—shRNA255

9、，pGPU6/GFP/Neo-shRNA554，pGPU6/GFP/Neo-shRNA593,和Negative-shRNA。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，shRNA255、shRNA554和shRNA593轉(zhuǎn)染率，比較得出shRNA554轉(zhuǎn)染率最高。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)RT-PCR和Western Blot檢測(cè)，shRNA255、shRNA554和shRNA593轉(zhuǎn)染Du145細(xì)胞后GSTP1基因mRNA含量，GSTP1蛋白含量，比較得出shRNA554轉(zhuǎn)染后G

10、STP1基因mRNA和蛋白含量均最低。轉(zhuǎn)染shRNA554后，DU145細(xì)胞第2、4、6天GSTP1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果，而空白質(zhì)粒組為174.35±7.2，168.09±6.54和171.72±8.25。轉(zhuǎn)染后GSTP1蛋白表達(dá)水平降低且隨轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)遞減，具有時(shí)間依賴性。轉(zhuǎn)染shRNA554后第2、4、6天MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，具有時(shí)間依賴性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)染組處于亞G1期細(xì)胞率高于空白質(zhì)粒組，且增殖指數(shù)降低。M

11、TT檢測(cè)轉(zhuǎn)染前不同濃度5-FU(μg/ml)作用后細(xì)胞存活率為95.6±2.11％(30)，90.2±0.86％(60)，83.1±3.12％(120)和74.6±1.32％(240)；轉(zhuǎn)染后不同濃度5-FU(μg/ml)作用后細(xì)胞存活率為91.3±1.43％(30)，84.6±2.13％(60)，73.2±1.52％(120)和65.5±0.94％(240)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前不同濃度5-FU(μg/ml)作用后亞G1期比率為5.3

12、7±0.43％(30)，6.49±2.06％(60)，9.02±0.34％(120)和12.33±2.46％(240)。增殖指數(shù)為47.54±2.33％(30)，46.69±2.12％(60)，46.01±1.87％(120)和44.29±1.78％(240)。而轉(zhuǎn)染后不同濃度5-FU(μg/ml)作用后亞G1期比率(凋亡期)為7.69±1.04％(30)，11.44±0.98％(60),13.57±3.44％(120)和22.42±0

13、.84％(240)。增殖指數(shù)為40.97±0.92％(30)，38.51±2.03％(60)，36.39±2.67％(120)和34.04±3.21％(240)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示轉(zhuǎn)染后相同5-FU濃度下細(xì)胞存活率降低，凋亡期比率上升，增殖指數(shù)下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染前不同濃度PA(μg/ml)作用后細(xì)胞存活率為98.5±2.34％(0.2)，95.2±1.32％(2)，89.4±0.68％(10)和82.

14、7±1.73％(20)；轉(zhuǎn)染后不同濃度PA(μg/ml)作用后細(xì)胞存活率為94.2±0.78％(0.2)，86.5±2.13％(2)，78.7±1.34％(10)和70.1±0.76％(20)；。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前不同濃度PA(gμ/ml)作用后亞G1期比率(凋亡期)為3.51±0.35％(0.2)，5.4±1.03％(2)，9.48±1.09％(10)和10.91±1.03％(20)。增殖指數(shù)為46.25±1.27％(0.2)，46

15、.05±1.98％(2)，41.75±2.44％(10)和41.04±1.71％(20)。而轉(zhuǎn)染后不同濃度PA(μg/ml)作用后亞G1期比率(凋亡期)為5.66±1.32％(0.2)，11.02±0.87％(2)，19.53±1.23％(10)和26.31±2.01％(20)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示轉(zhuǎn)染后相同PA濃度下細(xì)胞存活率降低，凋亡期比率上升，增殖指數(shù)下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義\。
　　 結(jié)論：1、表達(dá)載體介導(dǎo)GSTP1.shR

16、NA554轉(zhuǎn)染后可降低雄激素非依賴型前列腺癌DU145細(xì)胞GSTP1基因mRNA、GSTP1蛋白水平，抑制體外培養(yǎng)DU145增殖活性，并且呈現(xiàn)作用時(shí)間依賴性。
　　 2、表達(dá)載體介導(dǎo)GSTP1-shRNA554轉(zhuǎn)染后可將雄激素非依賴型前列腺癌DU145細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡，增殖指數(shù)下降。
　　 3、表達(dá)載體介導(dǎo)GSTP1-shRNA554轉(zhuǎn)染后提高雄激素非依賴型前列腺癌DU145細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，相同藥物濃度下轉(zhuǎn)染后DU1

17、45細(xì)胞存活率降低，凋亡期比率上升，增殖指數(shù)下降。
　　 目的：檢測(cè)細(xì)胞外信號(hào)激酶ERK抑制劑PD98059對(duì)DU145細(xì)胞GSTP1蛋白水平的影響，及其對(duì)細(xì)胞存活率和凋亡水平的影響。
　　 方法：將細(xì)胞外信號(hào)激酶ERK抑制劑PD98059作用DU145細(xì)胞，通過(guò)Western Blot檢測(cè)不同濃度PD98059對(duì)于P-ERK、GSTP1蛋白水平的影響，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末

18、端標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)DU145細(xì)胞凋亡水平。
　　 結(jié)果：不同濃度ERK抑制劑PD98059作用后P-ERK和GSTP1蛋白表達(dá)水平以吸光度表示，隨PD98059濃度增加細(xì)胞凋亡率升高，不同濃度組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：1、ERK抑制劑PD98059作用于DU145細(xì)胞后，對(duì)P-ERK、GSTP1蛋白表達(dá)呈抑制效應(yīng)，并且呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 2、ERK抑制劑PD98059作用于DU145細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)