幽門(mén)螺桿菌肽脫甲?；富虻目寺?、表達(dá)、純化及活性研究.pdf

1、幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)，是胃炎、消化道潰瘍的主要致病因素之一，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，由于人群感染率高、危害大，世界衛(wèi)生組織已將其列為第一類(lèi)致癌因子。傳統(tǒng)抗菌素治療存在著治愈率低、復(fù)發(fā)率高和菌株耐藥性等問(wèn)題，開(kāi)發(fā)新型的抗菌藥物成為亟待解決的問(wèn)題。 尋找特異、準(zhǔn)確的靶位是篩選新型抗菌藥物的關(guān)鍵。與哺乳動(dòng)物相比，細(xì)菌的蛋白合成具有其特點(diǎn)。細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，其多肽鏈N-端為甲?；牡鞍彼幔枰紫韧ㄟ^(guò)肽

2、脫甲酰基酶(peptidedeformylase，PDF)去除甲基后才能成為成熟蛋白，否則不能完成上述過(guò)程，細(xì)菌無(wú)法生長(zhǎng)。因此，PDF成為藥物篩選的新型和潛在的靶位。 本實(shí)驗(yàn)選擇了幽門(mén)螺桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株1株、澳大利亞株1株和我國(guó)不同地區(qū)(華北、華東、西南、華南)的12個(gè)分離株，對(duì)其def基因進(jìn)行了克隆及序列比較，并嘗試了在不同載體中進(jìn)行表達(dá)。根據(jù)GenBank已公布的幽門(mén)螺桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株26695、J99的肽脫甲?；富?def

3、ormylase，def)的核苷酸序列，在培養(yǎng)鑒定的基礎(chǔ)上提取細(xì)菌DNA，設(shè)計(jì)特異引物，以PCR方法擴(kuò)增了def,并克隆到pGEM-Teasy載體中。序列分析表明，所克隆的不同菌株的def基因均為525bp，核苷酸序列的一致性達(dá)到了97.50％，氨基酸序列的一致性高達(dá)98.13％，與功能相關(guān)的基序點(diǎn)未發(fā)生變異。這一結(jié)果表明，與其它細(xì)菌相同，Hp具有肽脫甲?；富?def)的高度保守性。本工作為表達(dá)PDF奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)，為以PDF為靶

4、位篩選抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。 選取和其它株同源性較高的DM株，將def基因克隆入pET-32a(+)表達(dá)載體，在宿主細(xì)胞BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果顯示，def基因可以融合蛋白的形式高效表達(dá)，但產(chǎn)物大部分以包涵體形式存在，可溶部分含量較低。通過(guò)金屬螯和親和層析法純化可溶性融合蛋白，腸激酶酶切后，獲得游離PDF；包涵體變性后，經(jīng)金屬螯和親和層析法純化，透析復(fù)性；經(jīng)檢測(cè)，可溶性融合蛋白、游離PDF和復(fù)性的包涵體蛋白均具有肽脫甲

5、?；富钚?。 為高效表達(dá)可溶性PDF蛋白，以更好地保持酶的活性，將def基因克隆入pET-22b(+)表達(dá)載體于BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量低，且多以包涵體的形式存在，結(jié)果不甚理想。將def基因克隆入pTrcHisB載體中，分別在宿主細(xì)胞TOP10、BL21(DE3)、DH5α、JM109中誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有在BL21(DE3)宿主細(xì)胞中獲高效表達(dá)，且產(chǎn)物以可溶狀態(tài)存在。以金屬螯和親和層析法進(jìn)行純化后檢測(cè)，顯示其具有