MicroRNA-21通過PTEN-PI3K-AKT信號(hào)通路調(diào)控C-kit+心臟干細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究背景及目的:干細(xì)胞移植治療成為再生修復(fù)梗死心肌的新趨勢(shì)。固有心臟干細(xì)胞(Cardiac Stem Cells,CSCs),不僅具有組織特異性和低免疫原性等特點(diǎn),而且可以多向分化為心肌譜系細(xì)胞,可顯著減輕心肌梗死后心室重構(gòu),改善心功能,故被認(rèn)為是目前細(xì)胞移植治療心肌梗死最為理想的種子細(xì)胞源。然而,心肌梗死后,局部微環(huán)境惡劣(氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng),缺血缺氧),致使外源性及內(nèi)源性干細(xì)胞存活量極少,增殖能力受限,不能有效揮再生修復(fù)心肌的作用。

2、因此,提高CSCs防御有害刺激的能力,抑制所移植細(xì)胞凋亡是提高細(xì)胞移植利用率并促使其發(fā)揮生物學(xué)功能的重要策略。研究顯示miR-21參與調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞及心血管譜系細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等過程。在多數(shù)腫瘤細(xì)胞及過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型中,過表達(dá)miR-21均可發(fā)揮有效的抗細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。眾所周知,PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和抗凋亡過程中均發(fā)揮重要作用。而miR-21的靶基因之一PTEN可抑制AKT信號(hào)通路活化

3、,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。因此,本研究擬探討過表達(dá)miR-21對(duì)常氧狀態(tài)下C-kit+CSCs增殖的影響及相關(guān)作用機(jī)制,同時(shí)通過過氧化氫處理C-kit+CSCs模擬心肌梗死后局部氧化應(yīng)激的微環(huán)境,探討過表達(dá)miR-21對(duì)C-kit+CSCs細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)作用機(jī)制。
  方法:
  第一部分
  1.按照本課題組前期已熟練掌握的酶消化法聯(lián)合磁珠分選法分離、培養(yǎng)并分選SD大鼠C-kit+CSCs,采用免

4、疫熒光檢測(cè)C-kti表達(dá)情況,采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞純度,并用于后續(xù)試驗(yàn)。
  2.以life2000TM為載體將miR-21的陰性對(duì)照及模擬物(50nM)轉(zhuǎn)染至C-kit+CSCs,設(shè)立不予任何處理正常細(xì)胞為對(duì)照組,采用RT-PCR分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h,各組C-kit+CSCs中miR-21的表達(dá)量,以此確定轉(zhuǎn)染效率及最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間。3.實(shí)驗(yàn)分為3組:①正常對(duì)照組(Control組):不予以任何處理的C-kit+C

5、SCs;②模擬物陰性對(duì)照組(mimics nagetive control,MNC組):轉(zhuǎn)染miR-21陰性對(duì)照的C-kit+CSCs;③模擬物組(Mimics組):轉(zhuǎn)染miR-21模擬物的C-kit+CSCs;以RT-PCR分別檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-21 mRNA表達(dá)量的變化。
  4.為驗(yàn)證體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的影響,分別①采用RT-PCR及免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞中心肌細(xì)胞早期標(biāo)記物Nkx2.5、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物C

6、D31、平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)情況,以此觀察體外轉(zhuǎn)染miR-21是否會(huì)促進(jìn)C-kit+CSCs的定向分化。②采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)初步觀察轉(zhuǎn)染miR-21對(duì)C-kit+CSCs遷移的影響。③采用CCK8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h三組細(xì)胞活力情況,根據(jù)CCK8結(jié)果,選擇細(xì)胞活力最佳時(shí)間點(diǎn),以Edu法進(jìn)一步檢測(cè)該時(shí)間點(diǎn)時(shí)各組細(xì)胞的增殖狀態(tài)。采用Western blot檢測(cè)此時(shí)各組細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白Brdu表達(dá)。<

7、br>  5.上述研究結(jié)果表明,過表達(dá) miR-21可在一定程度上促進(jìn)常氧狀態(tài)下 C-kit+CSCs的細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步探討PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路是否在過表達(dá)miR-21促進(jìn)C-kit+CSCs增殖這一現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用,故將實(shí)驗(yàn)分為五組,①Control組:不予以任何處理的C-kit+CSCs;②MNC組:轉(zhuǎn)染 miR-21模擬物陰性對(duì)照48h的C-kit+CSCs;③Mimics組:轉(zhuǎn)染miR-21模擬物48h的C-k

8、it+CSCs;④Phen組:加入 PTEN抑制劑 Phen處理1h的C-kit+CSCs,作為 miR-21陽(yáng)性對(duì)照;⑤Mimics+LY294002組:轉(zhuǎn)染miR-21模擬物48h后予以LY294002處理1小時(shí)。同時(shí)采用 Edu檢測(cè)各組的增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組的細(xì)胞周期,Western blot檢測(cè)各組中增殖相關(guān)蛋白Brdu表達(dá),RT-PCR分別檢測(cè)各組中PTEN mRNA的表達(dá)量變化,Western blot檢測(cè)通路相關(guān)蛋

9、白PTEN,P-AKT,T-AKT的蛋白表達(dá)情況。
  第二部分
  6.以不同濃度的H2O2(200、100、50μM)處理C-kit+CSCs2h模擬不同程度的氧化應(yīng)激微環(huán)境,設(shè)立不加H2O2的C-kit+CSCs為對(duì)照組,收集細(xì)胞后行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)C-kit+CSCs的存活率、早期凋亡率和壞死率,確定H2O2誘導(dǎo)C-kit+CSCs早期凋亡的最佳合理濃度以模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境。
  7.為探討過表達(dá)miR-21對(duì)氧

10、化應(yīng)激狀態(tài)下C-kit+CSCs細(xì)胞凋亡的影響,實(shí)驗(yàn)分為六個(gè)組:①對(duì)照組(Control),②模擬物陰性對(duì)照組(mimics nagetive control, MNC),③模擬物組(Mimics),④Control+H2O2組,⑤MNC+H2O2組,⑥Mimics+H2O2組。轉(zhuǎn)染組中予以模擬物及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染48h,在H2O2組中加入H2O2(100μM)處理2h。采用 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-21 mRNA的相對(duì)表達(dá)量;采

11、用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組C-kit+CSCs的凋亡率;采用免疫熒光檢測(cè)各組中促凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)情況;采用Western blot檢測(cè)各組中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)情況。
  8.為進(jìn)一步探討PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路是否在過表達(dá)miR-21抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)下C-kit+CSCs細(xì)胞凋亡這一現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用,將實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)組:①對(duì)照組(Control),②Control+H2

12、O2組,③Control+H2O2+Phen組,④Mimics+H2O2組,⑤Mimics+H2O2+LY294002組;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率;采用免疫熒光法檢測(cè)各組中促凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)情況;采用Western blot檢測(cè)各組凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平;采用RT-PCR檢測(cè)各組miR-21 mRNA及PTEN mRNA的表達(dá)水平;采用Western blot檢測(cè)各組中通

13、路相關(guān)蛋白PTEN,P-AKT,T-AKT的蛋白表達(dá)情況。
  結(jié)果:
  第一部分
  1.體外分離培養(yǎng)的原代CSCs培養(yǎng)48h后可見部分細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng),鏡下觀察細(xì)胞呈圓形亮點(diǎn)狀、部分細(xì)胞貼壁。4-5天后CSCs變?yōu)槎嘟切位蛉切危?-8天時(shí)鏡下可見細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底。磁珠分選后行免疫熒光鑒定結(jié)果顯示,表達(dá)c-kit的CSCs達(dá)90%以上,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)C-kit+CSCs表面標(biāo)記,結(jié)果顯示:CSCs中表達(dá)c-k

14、it的CSCs達(dá)90.2%,表達(dá)CD45的CSCs僅1.8%,表達(dá)CD34的CSCs僅1.0%。
  2.以life2000TM為載體將miR-21模擬物(50nM)轉(zhuǎn)染至C-kit+CSCs,以正常未處理細(xì)胞為對(duì)照,采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后各組miR-21表達(dá)情況。結(jié)果表明,各時(shí)間點(diǎn)中,與Control組相比,Mimics組miR-21表達(dá)量顯著增高(P<0.05),其中以轉(zhuǎn)染48h時(shí)miR-21表達(dá)量最

15、高。轉(zhuǎn)染48h時(shí),與Control組相比, MNC組miR-21表達(dá)量無(wú)明顯增加或減少(P>0.05),而Mimics組顯著增高(P<0.05)。因此,以轉(zhuǎn)染48h為作用條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
  3. RT-PCR結(jié)果表明,三組內(nèi) Nkx2.5和 CD31、α-SMA mRNA水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Control組相比,Mimics組和MNC組細(xì)胞內(nèi)心肌細(xì)胞譜系標(biāo)記物Nkx2.5和CD31、α-SM

16、A表達(dá)均無(wú)顯著差異。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),三組之間細(xì)胞遷移能力無(wú)明顯不同。
  4. CCK8結(jié)果顯示,與Control組相比,轉(zhuǎn)染miR-21模擬物24、48、72h后C-kit+CSCs細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05),其中以轉(zhuǎn)染48h時(shí)細(xì)胞活力達(dá)高峰(P<0.05),而MNC組無(wú)顯著差異(P>0.05)。采用Edu檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染48h時(shí),與Control組相比,Mimics組細(xì)胞增殖能力顯著增高(P<0

17、.05),而MNC組無(wú)顯著差異(P>0.05)。采用Weston blot檢測(cè)各組增殖相關(guān)蛋白Brdu表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48h時(shí),與Control組相比,Mimics組Brdu蛋白顯著增高(p<0.05),而MNC組明顯增加或減少(P>0.05),與其Edu熒光結(jié)果一致。
  5.為進(jìn)一步探討 PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路是否在過表達(dá) miR-21促進(jìn) C-kit+CSCs細(xì)胞增殖這一現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用,將實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)組,E

18、du檢測(cè)結(jié)果顯示:與Control組比,MNC組細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯改變(P>0.05),Mimics組及Phen組中細(xì)胞增殖活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)。與 Mimics組比, Mimics+LY294002組中細(xì)胞增殖能力受到抑制(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期變化發(fā)現(xiàn),與 Control相比, MNC組各周期細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05),Mimics組及Phen組增殖的心臟干細(xì)胞突破 G1/S期限制點(diǎn)進(jìn) S期,細(xì)胞增

19、殖能力增強(qiáng)(P<0.05);與Mimics組相比,Mimics+LY294002細(xì)胞S期細(xì)胞明顯降低(P<0.05)。Western blot檢測(cè)各組增殖相關(guān)蛋白Brdu的結(jié)果與各組Edu及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,與Control組相比,PTEN mRNA在Phen組中顯著降低(P<0.05),而在Mimics組、MNC組、Mimics+LY294002中無(wú)顯著變化(P>0.05)。Western blot結(jié)果表明

20、,與Control組相比,MNC組中PTEN及AKT通路蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05),Mimics組或是Phen組中,PTEN蛋白表達(dá)明顯降低,磷酸化AKT蛋白表達(dá)顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與Mimics組比, Mimics+LY294002組中PTEN蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05),但磷酸化AKT信號(hào)蛋白較Mimics組降低(P<0.05)。各組細(xì)胞內(nèi)總AKT蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)。

21、  第二部分
  6.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與Control、50、200μM H2O2處理組相比,100μM H2O2處理C-kit+CSCs2h可導(dǎo)致C-kit+CSCs早期凋亡率達(dá)到最大值(P<0.05),而壞死率無(wú)明顯變化(P>0.05)。因此選定100μM H2O2處理C-kit+CSCs2h作為誘導(dǎo)C-kit+CSCs凋亡的最佳合理濃度和時(shí)間,以于體外模擬心肌梗死后氧化應(yīng)激微環(huán)境。
  7.采用RT-PCR檢測(cè)各組

22、中miR-21表達(dá)變化,結(jié)果顯示,與Control組相比,Mimics組中miR-21表達(dá)顯著增加(P<0.05),而MNC組中miR-21表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)。予以100μmol/L H2O2處理C-kit+CSCs2h模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境后,與Control組相比,Control+H2O2組和MNC+H2O2組中miR-21表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。與Control+H2O2組相比,Mimics+H2O2組中miR-21

23、表達(dá)量明顯升高(P<0.05),但與Mimics組相比,其miR-21表達(dá)量降低(P<0.05)。
  8.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示,與Control組相比,Mimics組和MNC組凋亡率無(wú)顯著差異(P>0.05)。予以100μmol/L H2O2處理C-kit+CSCs2h模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境后,與Control相比, Control+H2O2組、MNC+H2O2組中細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.05),該兩組間細(xì)

24、胞凋亡無(wú)明顯差異(P>0.05)。Mimics+H2O2組與Control組相比,凋亡率升高(P<0.05),但與Control+H2O2組相比,其凋亡率明顯降低(P<0.05)。免疫熒光顯示,與Control組比,Mimics組Caspase-3表達(dá)無(wú)變化,而MNC+H2O2組和Control+H2O2組細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)均明顯增加;與Control+H2O2組相比,Mimics+H2O2組中Caspase-3表達(dá)明顯減少。

25、Western blot檢測(cè)顯示Control組、 MNC組、Mimics組中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量三者之間比較無(wú)明顯差異(P>0.05);予以100μmol/L H2O2處理C-kit+CSCs2h模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境后,與Control組相比, Control+H2O2組和MNC+H2O2組中凋亡蛋白Caspase-3及Bax的表達(dá)增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低(P<0.05);與Contr

26、ol+H2O2組相比,Mimics+H2O2組中Caspase-3及Bax的蛋白表達(dá)減少,抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。
  9.為進(jìn)一步探討PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路是否在過表達(dá)miR-21抑制氧化應(yīng)激環(huán)境中C-kit+CSCs凋亡這一現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用,將實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)組。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,與Control相比, Control+H2O2組細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05),而Phen+H2O2組和M

27、imics+H2O2組可明顯減少細(xì)胞凋亡(P<0.05);與Mimics+H2O2組相比, Phen+H2O2組細(xì)胞凋亡率升高具有顯著性(P<0.05),Mimics+H2O2+LY294002組細(xì)胞凋亡率及壞死率均顯著增高(P<0.05),但仍較Control+H2O2組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Control組比, Control+H2O2組細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)量均明顯增加。與Control+H2O

28、2組相比,Phen+H2O2組及Mimics+H2O2組中Caspase-3表達(dá)量明顯減少,與Mimics+H2O2組比,Mimics+H2O2+LY294002組細(xì)胞Caspase-3表達(dá)顯著增加。同時(shí)行Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與Control組相比,Control+H2O2組中促凋亡蛋白Caspase-3及Bax的蛋白表達(dá)增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)降低(P<0.05);而Phen+H2O2組和Mimics+H

29、2O2組中促凋亡蛋白Caspase-3及Bax的蛋白表達(dá)減少,抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)增高(P<0.05);與Mimics+H2O2組相比,Mimics+H2O2+LY294002組中促凋亡蛋白Caspase-3及Bax的蛋白表達(dá)增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)減少(P<0.05)
  10. RT-PCR結(jié)果顯示:與Control組相比,Control+H2O2組及Phen+H2O2組細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)降低,差

30、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而后兩組間miR-21表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05),Mimics+H2O2組與Mimics+H2O2+LY294002組中miR-21表達(dá)顯著增高(P<0.05),該兩組中miR-21表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05);與Control組比,Control+H2O2組中PTEN mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05),Control+H2O2+phen組中PTEN mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)。與C

31、ontrol+H2O2組相比, Mimics+H2O2組和Mimics+H2O2+LY294002組中PTEN mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。Western blot檢測(cè)顯示,與Control組相比,Control+H2O2組中PTEN蛋白表達(dá)明顯增加,p-AKT蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);而Phen+H2O2組和Mimics+H2O2組中PTEN蛋白表達(dá)表達(dá)減少,p-AKT蛋白表達(dá)增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05

32、);與Mimics+H2O2組相比,Mimics+H2O2+LY294002組中PTEN及p-AKT蛋白表達(dá)均顯著減少(P<0.05)??侫KT蛋白在各組表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)。
  結(jié)論:
  1.本實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)分選出高純度且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的C-kit+CSCs。
  2.以life2000TM為載體可成功將miR-21轉(zhuǎn)染至C-kit+CSCs內(nèi),且轉(zhuǎn)染48小時(shí)時(shí)細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)量最高。
  3.過表

33、達(dá)miR-21對(duì)C-kit+CSCs的分化潛能及細(xì)胞遷移作用無(wú)明顯影響。
  4.過表達(dá)miR-21可促進(jìn)常氧狀態(tài)下C-kit+CSCs增殖,而PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路可能在這一過程中發(fā)揮重要作用。
  5.100μMH2O2處理細(xì)胞2h可成功建立C-kit+CSCs的體外早期凋亡模型以模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境。
  6.過表達(dá)miR-21可減少氧化應(yīng)激狀態(tài)中C-kit+CSCs的細(xì)胞凋亡,其可能是通過PTEN/P

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