接頭蛋白Gab1通過PI3K-AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)bFGF誘導(dǎo)的血管生成.pdf

1、目的：
　　探討生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2相關(guān)的接頭蛋白1（Gab1）在堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管過程中的作用及分子機(jī)制，為周圍動(dòng)脈閉塞性疾病的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　利用小干擾RNA-慢病毒載體技術(shù)轉(zhuǎn)染人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞融合株（Eahy926）細(xì)胞，特異干擾 Eahy926細(xì)胞 Gab1基因，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白電泳的方法驗(yàn)證所構(gòu)建的LV-Gab1-siR

2、NA載體能否成功干擾Eahy926細(xì)胞Gab1蛋白的表達(dá)。Western blot檢測(cè)pAKT、AKT的表達(dá)量確定bFGF作用于Eahy926細(xì)胞的最佳刺激濃度和時(shí)間。基質(zhì)膠小管形成實(shí)驗(yàn)直觀觀察接頭蛋白Gab1對(duì)bFGF誘導(dǎo)Eahy926細(xì)胞形成血管狀結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步通過蛋白電泳檢測(cè)細(xì)胞增殖與分化下游信號(hào)通路蛋白pGab1、AKT、pAKT等蛋白的表達(dá)情況，研究其信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　結(jié)果：
　?、賅estern blo

3、t結(jié)果顯示在bFGF終濃度為30ng/ml時(shí)Eahy926細(xì)胞pAKT蛋白條帶最清楚，與其他濃度組相比，AKT活化百分?jǐn)?shù)最高。
　?、赪estern blot結(jié)果顯示在bFGF終濃度為30ng/ml、刺激時(shí)間為30min時(shí)Eahy926細(xì)胞pAKT蛋白條帶最清楚，與其他刺激時(shí)間組相比，AKT活化百分?jǐn)?shù)最高。
　?、墼诘怪脽晒怙@微鏡下對(duì)比熒光視野和明視野表明在MOI值為100時(shí)，Eahy926細(xì)胞高表達(dá)綠色熒光蛋白。
　

4、　④實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示Gab1 siRNA組Eahy926細(xì)胞Gab1 mRNAs表達(dá)明顯減少。
　?、莼|(zhì)膠小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Gab1 siRNA組Eahy926細(xì)胞小管形成長(zhǎng)度明顯較短，且所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且多不完整。
　　⑥Western blot檢測(cè)下游信號(hào)通路蛋白分子結(jié)果示：Gab1 siRNA組pAKT條帶明顯較模糊，AKT活化百分?jǐn)?shù)明顯降低。
　　結(jié)論：
　?、袤w外bFGF刺激Eahy9