lncRNA-AK055783通過ERBB2-PI3K-AKT信號通路調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)制研究.pdf

1、背景:胃癌是全世界最常見的、發(fā)病率和致死率極高的惡性腫瘤之一。盡管胃癌的診斷和治療手段取得了一些進(jìn)步，但是由于其高度復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特性，導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后依然很差，5年生存率低于20％。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)有效的胃癌治療新方法具有十分重要的意義。
　　長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200nt、不編碼蛋白質(zhì)、不直接參與蛋白質(zhì)合成的RNA分子。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA

2、參與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生物學(xué)過程，并與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如在卵巢癌、大腸癌、前列腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中，均有多篇lncRNA異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和患者預(yù)后相關(guān)的報道。然而，胃癌相關(guān)lncRNA的作用及其機(jī)制研究報道還較少。因此，本研究擬尋找與胃癌相關(guān)異常表達(dá)的lncRNA，探索其效應(yīng)及作用機(jī)制，將有助于進(jìn)一步深入理解胃癌的分子基礎(chǔ)。
　　方法:通過GSEA和GCBI數(shù)據(jù)分析，遴選在胃癌中差異性表達(dá)的lnc

3、RNA，通過RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行驗證，篩選出符合要求的lncRNA，分析lncRNA的表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。將干擾和過表達(dá)lncRNA的慢病毒感染胃癌細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定沉默和過表達(dá)lncRNA的胃癌細(xì)胞株。通過MTT、平板克隆形成、Transwell等實驗，觀察lncRNA表達(dá)變化對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。并建立人胃癌

4、裸鼠移植瘤模型，檢測lncRNA siRNA體內(nèi)抑瘤效果。最后利用RNA-IP和RNA pull down技術(shù)，尋找lncRNA結(jié)合并調(diào)控的靶蛋白，通過Pathway分析和Western Blot實驗檢測其調(diào)控的信號通路。
　　結(jié)果:通過生物信息學(xué)分析獲得胃癌顯著相關(guān)lncRNA-AK055783，該lncRNA與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其作用機(jī)制尚未被報道。通過RT-PCR方法確證，lncRNA-AK055783在MGC803、BG

5、C823、SGC7901、MKN45和AGS5種胃癌細(xì)胞中均檢測到表達(dá)，在MGC803中表達(dá)水平最低，MKN45中表達(dá)水平最高。其在胃癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(t=10.66，p＜0.001)，并且與胃癌的T分期(x2=5.275，p＜0.05)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(x2=4.546，p＜0.05)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(x2=4.305，p＜0.05)具有顯著相關(guān)性。根據(jù)lncRNA-AK055783在46例胃癌標(biāo)本中的中位表達(dá)水平（lncRN

6、A-AK055783表達(dá)變化倍數(shù)4.527）分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，通過生存分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AK055783高表達(dá)組患者1、2和3年生存率為73.6％、54.8％和41.5％，而lncRNA-AK055783低表達(dá)組患者1、2和3年生存率為94.1％、77.5％和64.7％，Kaplan-Meier生存分析顯示，高表達(dá)lncRNA-AK055783組患者生存期顯著短于低表達(dá)組(p=0.0109，Mantel-Cox Test)。

7、
　　設(shè)計干擾lncRNA-AK055783的shRNA和過表達(dá)lncRNA-AK055783質(zhì)粒并用慢病毒包裝，感染胃癌MGC803和MKN45細(xì)胞株，構(gòu)建穩(wěn)定沉默和過表達(dá)lncRNA-AK055783的胃癌細(xì)胞株。體外通過MTT、平板克隆形成和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNA-AK055783表達(dá)，能顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。小鼠體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，干擾lhcRNA-AK055783表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞在裸鼠體

8、內(nèi)生長，并抑制胃癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;而lncRNA-AK055783過表達(dá)，則可顯著促進(jìn)MGC803在裸鼠皮下的生長以及淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步通過免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation，RNA-IP)和RNA pull down技術(shù)發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AK055783能夠特異性結(jié)合ERBB2蛋白。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AK055783與ERBB2/PI3K/AKT信號通路顯著相關(guān)。熒光素酶

9、報告基因檢測顯示lncRNA-AK055783過表達(dá)導(dǎo)致了ERBB2活性增加。Western Blot檢測顯示，lncRNA-AK055783過表達(dá)時，ERBB2蛋白水平明顯升高，進(jìn)而激活了PI3K/AKT信號通路;干擾lncRNA-AK055783后，ERBB2蛋白水平明顯下降，PI3K/AKT信號通路也隨之被抑制。以上結(jié)果提示lncRNA-AK055783通過激活ERBB2/PI3K/AKT信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。