組蛋白H3精氨酸單ADP核糖基化對(duì)大腸癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)影響的初步研究.pdf

1、研究目的:初步探討大腸癌組蛋白H3精氨酸單ADP核糖基化修飾對(duì)大腸癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)的影響及其可能的機(jī)制。
　　方法:本課題分為四部分。
　　1.單腺苷二磷酸核糖基化轉(zhuǎn)移酶ARTD8和ARTD14在人大腸腺癌組織中的表達(dá)及意義:采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)65例大腸癌組織標(biāo)本分別檢測(cè)ARTD8和ARTD14在大腸癌組織的表達(dá)情況。
　　2.不同分化程度大腸癌細(xì)胞株組蛋白單ADP核糖基化修飾差異檢測(cè):應(yīng)用四級(jí)串聯(lián)質(zhì)

2、譜檢測(cè)人大腸癌LOVO細(xì)胞株和SW480細(xì)胞株中組蛋白單ADP核糖基化修飾的差異。
　　3.組蛋白H3第117位精氨酸單ADP核糖基化對(duì)大腸癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)及癌細(xì)胞遷移能力的影響：（1）分別將 pLenti-H3 mut1-IRES-eGFP和pLenti-H3 mut2-IRES-eGFP慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人大腸癌LOVO細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定氨基酸突變細(xì)胞株。（2）Western Blot和 QPCR分別檢測(cè)未轉(zhuǎn)染 L

3、OVO細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載體 LOVO細(xì)胞組（LV-control LOVO細(xì)胞組）、H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組中E-cadherin蛋白和mRNA水平。（3）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移能力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)胞組、H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組癌細(xì)胞遷移能力。
　　4.組蛋白H3第117位精氨酸單 ADP核糖基化對(duì)大腸

4、癌細(xì)胞E-cadherin影響的分子機(jī)制研究:（1）Western Blot檢測(cè)未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)胞組、H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組中PARP1蛋白水平。（2）Western Blot檢測(cè)未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)胞組、H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組中H3K9甲基化水平。（3）QPCR檢測(cè)未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載體LO

5、VO細(xì)胞組、H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組中FBP1的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：
　　1.單腺苷二磷酸核糖基化轉(zhuǎn)移酶ARTD8和ARTD14在人大腸腺癌組織中的表達(dá)及意義。
　　(1)ARTD8在大腸腺癌和正常大腸組織中均有表達(dá)，在大腸腺癌細(xì)胞，ARTD8主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，同時(shí)見(jiàn)于部分細(xì)胞核中；在正常大腸黏膜腺體，則僅分布于細(xì)胞質(zhì)中。ARTD8在大腸腺癌組織中表達(dá)強(qiáng)度高于正常

6、大腸黏膜細(xì)胞（P<0.05）。直腸腺癌細(xì)胞ARTD8核陽(yáng)性表達(dá)率高于正常大腸黏膜（ P<0.05），同時(shí)高于結(jié)腸腺癌細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)率（P<0.05）。
　　(2)ARTD14在大腸腺癌和正常大腸組織中均有表達(dá)，在大腸腺癌細(xì)胞，ARTD14主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，同時(shí)見(jiàn)于部分細(xì)胞核中；在正常大腸黏膜腺體，則僅分布于細(xì)胞質(zhì)中。ARTD14在大腸腺癌組織中表達(dá)強(qiáng)度高于正常大腸黏膜細(xì)胞（P<0.05），并與腫瘤的分化程度存在相關(guān)性（P<0.0

7、5）。結(jié)腸腺癌細(xì)胞 ARTD14核陽(yáng)性表達(dá)率高于正常大腸黏膜（P<0.05）。
　　2.不同分化程度人大腸癌細(xì)胞株中組蛋白單 ADP核糖基化修飾的檢測(cè):四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果顯示，LOVO細(xì)胞組蛋白H3的第117位精氨酸存在單ADP核糖基化修飾，而SW480細(xì)胞組蛋白H3第117位則不存在這一修飾。
　　3.組蛋白H3第117位精氨酸單ADP核糖基化對(duì)大腸癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)及癌細(xì)胞遷移能力的影響。
　　(1)

8、將pLenti-H3 mut1-IRES-eGFP和pLenti-H3 mut2-IRES-eGFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染至人大腸癌LOVO細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)胞、H3 R117A LOVO細(xì)胞和H3 R117K LOVO細(xì)胞均可以見(jiàn)到綠色熒光，而且熒光細(xì)胞達(dá)到總細(xì)胞數(shù)的80％。
　　(2)Western Blot、QPCR結(jié)果顯示H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組E-cadhe

9、rin蛋白和mRNA水平較未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載體 LOVO細(xì)胞組 E-cadherin蛋白和 mRNA水平明顯增加。未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組與轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)胞組無(wú)明顯差異，H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組無(wú)差異。
　　(3)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組中細(xì)胞的遷移能力比未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載

10、體LOVO細(xì)胞組低。未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組與轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)胞組無(wú)明顯差異，H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組無(wú)差異。
　　4.組蛋白H3第117位精氨酸單ADP核糖基化對(duì)大腸癌細(xì)胞E-cadherin影響的分子機(jī)制研究
　　(1)Western Blot結(jié)果顯示H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組中PARP1蛋白水平較未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)

11、胞組明顯降低。未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組與轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)胞組無(wú)明顯差異，H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組無(wú)差異。
　　(2)Western Blot結(jié)果顯示H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組中H3K9me2水平較未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)胞組明顯下降。未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組與轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)胞組無(wú)明顯差異，H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R

12、117K LOVO細(xì)胞組無(wú)差異。
　　(3)QPCR結(jié)果顯示H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組中FBP1 mRNA水平較未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)胞組明顯增加。未轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞組與轉(zhuǎn)染空載體LOVO細(xì)胞組無(wú)明顯差異， H3 R117A LOVO細(xì)胞組和H3 R117K LOVO細(xì)胞組無(wú)差異。
　　結(jié)論：
　　1.ARTD8和ARTD14在大腸癌組織表達(dá)強(qiáng)度較正常大腸組織

13、高，ARTD14表達(dá)與大腸癌分化程度存在相關(guān)性，提示ARTD8和ARTD14可能與大腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)；直腸腺癌細(xì)胞ARTD8核陽(yáng)性表達(dá)率高于正常大腸黏膜、結(jié)腸腺癌細(xì)胞ARTD14核陽(yáng)性表達(dá)率高于正常大腸黏膜，提示大腸癌核內(nèi)也存在著單ADP核糖基化作用，ARTD8和ARTD14可能影響組蛋白單ADP核糖基化修飾對(duì)大腸癌發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，但具體作用氨基酸位點(diǎn)尚有待進(jìn)一步研究。
　　2.組蛋白H3第117位精氨酸單ADP核糖基化作用可以影響