組蛋白H3精氨酸特異性單ADP核糖基化對人結(jié)腸癌LOVO細胞增殖、凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、目的：探討組蛋白H3精氨酸單ADP核糖基化對人結(jié)腸癌LOVO細胞增殖、凋亡的影響及其可能機制。
　　方法：構(gòu)建組蛋白H3精氨酸單ADP核糖基化修飾位點突變慢病毒表達載體pLenti-H3 mut1-IRES-eGFP和pLenti-H3 mut2-IRES-eGFP，將慢病毒轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌LOVO細胞并篩選出穩(wěn)定表達的突變株，同時將LOVO細胞分為未轉(zhuǎn)染LOVO細胞、轉(zhuǎn)染空載體(LV-control)LOVO細胞，H3-mut1(

2、H3A117) LOVO細胞和H3-mut2(H3K117) LOVO細胞四組。采用CCK-8檢測各組細胞增殖情況差異，流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布及細胞凋亡；同時，通過構(gòu)建裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型，觀察各組裸鼠移植瘤生長情況。qRT-PCR檢測各組細胞中RASSF1A的mRNA表達差異。運用Werstern Blot檢測各組細胞中H3K9二甲基化水平以及RASSF1A、Bcl-2、Bax、Cyclin D1的蛋白表達差異。
　　結(jié)果：

3、
　　1.慢病毒成功感染LOVO細胞，并篩選獲得穩(wěn)定表達的突變株。
　　2.CCK8結(jié)果提示H3-mut1(H3A117)和H3-mut2(H3K117)兩組LOVO細胞的增殖抑制率明顯高于未轉(zhuǎn)染組和LV-control組LOVO細胞（P＜0.05）；而未轉(zhuǎn)染組和LV-control組LOVO細胞之間以及H3-mut1(H3A117)和H3-mut2(H3K117)兩組LOVO細胞之間的增殖能力均無明顯差異（P＞0.05）。

4、
　　3.細胞周期檢測結(jié)果提示H3-mut1(H3A117)、H3-mut2(H3K117)兩組LOVO細胞與未轉(zhuǎn)染組和LV-control組LOVO細胞相比，細胞分裂處于G1期的細胞比例增加，增殖指數(shù)下降（P＜0.05）；而未轉(zhuǎn)染組和LV-control組LOVO細胞之間以及H3-mut1(H3A117)和H3-mut2(H3K117)兩組LOVO細胞之間的增殖指數(shù)均無明顯差異（P＞0.05）。
　　4.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示

5、，H3-mut1(H3A117)、H3-mut2(H3K117)兩組LOVO細胞的凋亡率明顯高于未轉(zhuǎn)染組和LV-control組LOVO細胞（P＜0.05）；而未轉(zhuǎn)染組和LV-control組LOVO細胞之間以及H3-mut1(H3A117)和H3-mut2(H3K117)兩組LOVO細胞之間的凋亡率均無明顯差異（P＞0.05）。
　　5.裸鼠皮下移植瘤模型顯示，注射H3-mut1(H3A117)、H3-mut2(H3K117)兩

6、組LOVO細胞的裸鼠與注射未轉(zhuǎn)染組和LV-control組LOVO細胞的裸鼠模型相比，其瘤體重量和體積明顯減?。≒＜0.05）；而未轉(zhuǎn)染組和LV-control組裸鼠模型瘤體之間以及H3-mut1(H3A117)和H3-mut2(H3K117)兩組裸鼠模型瘤體之間的重量、體積均無明顯差異（P＞0.05）。
　　6.qRT-PCR結(jié)果顯示，H3-mut1(H3A117)、H3-mut2(H3K117)兩組LOVO細胞的RASSF1A

7、 mRNA表達水平明顯高于未轉(zhuǎn)染組和LV-control組LOVO細胞（P＜0.05）；而未轉(zhuǎn)染組和LV-control組LOVO細胞之間以及H3-mut1(H3A117)和H3-mut2(H3K117)兩組LOVO細胞之間的RASSF1A mRNA表達水平均無明顯差異（P＞0.05）。
　　7.Western Blot結(jié)果顯示，各組細胞中H3-mut1(H3A117)、H3-mut2(H3K117)兩組與未轉(zhuǎn)染組和LV-cont

8、rol組相比，其RASSF1A、Bax蛋白表達水平明顯增高（P＜0.05），H3K9二甲基化水平以及Bcl-2、Cyclin D1的蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；而未轉(zhuǎn)染組和LV-control組之間以及H3-mut1(H3A117)和H3-mut2(H3K117)兩組之間各項指標均無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：組蛋白H3精氨酸特異性單ADP核糖基化位點突變可以抑制人結(jié)腸癌LOVO細胞增殖，促進LOVO細胞凋亡，