胃癌細胞中DNMT3A2對E-cadherin表達表觀調控機制的初步研究.pdf

1、目的:探討胃癌中DNMT3A2調控E-cadherin表達的表觀調控機制。
　　方法:采用RT-qPCR方法檢測E-cadherin在胃癌組織病例中的表達模式，并統(tǒng)計分析E-cadherin的差異表達與DNMT3A2在胃癌組織病例中表達的相關性。TGF-β持續(xù)誘導胃癌細胞使細胞出現(xiàn)EMT表型，應用RT-qPCR方法檢測細胞中DNMT3A2的表達，同時應用Western Blot檢測E-cadherin蛋白的表達。構建穩(wěn)定過表達和穩(wěn)

2、定干擾DNMT3A2的胃癌細胞系，分別在穩(wěn)定過表達和干擾DNMT3A2的細胞中檢測E-cadherin的表達。IP實驗分析并驗證DNMT3A2與組蛋白甲基轉移酶EZH2、G9a的結合關系，應用RT-qPCR分析穩(wěn)定過表達DNMT3A2的細胞中瞬時干擾EZH2、G9a以及SUV39H1后E-cadherin的表達變化。設計兩條抑制Snail基因的小干擾RNA，在穩(wěn)定過表達DNMT3A2的胃癌細胞中瞬時干擾Snail基因，RT-qPCR檢測

3、E-cadherin的表達水平。應用全基因組甲基化測序技術檢測干擾DNMT3A2后對全基因組甲基化水平的影響。
　　結果:1）在34例胃癌病例中分析E-cadherin的表達，發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織病例中呈現(xiàn)低表達模式，低表達率達54％。統(tǒng)計分析DNMT3A2與E-cadherin在胃癌組織病例中表達的相關性，結果顯示在DNMT3A2高表達組中，E-cadherin的平均表達量低;而在DNMT3A2低表達組中E-cadherin的平均表

4、達量高。兩者的表達水平呈現(xiàn)負相關趨勢。
　　2) TGF-β誘導胃癌細胞MKN45和BGC823后，細胞發(fā)生明顯的EMT表型，即細胞形態(tài)由上皮樣向間質樣轉變。分別應用RT-qPCR和Western Blot檢測DNMT3A2和E-cadherin的表達，結果顯示細胞發(fā)生EMT后，DNMT3 A2表達上調與此同時E-cadherin表達下調。
　　3)構建穩(wěn)定過表達和穩(wěn)定干擾DNMT3A2的胃癌細胞系，分別在穩(wěn)定過表達和干擾D

5、NMT3A2的細胞中檢測E-cadherin的表達，當DNMT3A2過表達時，E-cadherin與對照相比表達下調;反之在DNMT3A2低表達的細胞中E-cadherin表達上調。
　　4)IP實驗驗證DNMT3A2與組蛋白甲基轉移酶EZH2、G9a存在直接相互作用，在過表達DNMT3A2的胃癌細胞系中瞬時干擾組蛋白甲基轉移酶EZH2、G9a以及SUV39H1的表達，發(fā)現(xiàn)在這三個組蛋白甲基轉移酶表達被抑制后，E-cadherin

6、的表達有所恢復，證明DNMT3A2可以協(xié)調組蛋白甲基轉移酶共同調控E-cadherin的表達。
　　5)在過表達DNMT3A2的胃癌細胞中瞬時干擾Snail，E-cadherin的表達上調，說明Snail對E-cadherin的表達也起到調控作用。
　　6)在穩(wěn)定干擾DNMTA2的胃癌細胞以及對照細胞中檢測全基因組甲基化水平，結果顯示干擾DNMT3A2后，全基因組甲基化水平降低，與癌癥有關的信號通路受到影響，且會影響E-ca

7、dherin的表達。
　　結論:根據以上實驗及研究結果，本研究得到以下結論，
　　1.E-cadherin在胃癌組織病例中呈現(xiàn)低表達模式，且E-cadherin的表達水平與DNMT3A2的表達水平呈負相關。
　　2.DNMT3A2在胃癌細胞中可以抑制E-cadherin的表達。
　　3.DNMT3A2可以協(xié)同組蛋白甲基轉移酶EZH2、G9a以及SUV39H1共同調控DNMT3A2的表達。
　　4.Snail