“炎癥”和健康牙周組織來源干細(xì)胞及其細(xì)胞膜片的功能：同一患者配對研究.pdf

1、研究背景：
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，相對于牙周組織健康牙齒分離而來的干細(xì)胞（H-PDLSCs），牙周炎患牙處炎癥組織中同樣存在干細(xì)胞，即“炎癥”牙周膜干細(xì)胞（I-PDLSCs），且因其來源更加廣泛、倫理學(xué)問題較少、易于患者接受等優(yōu)勢，具有良好的臨床應(yīng)用潛能，有望應(yīng)用于將來的組織工程和再生醫(yī)學(xué)中?？上У氖牵S著對“炎癥”干細(xì)胞性能研究的深入，部分學(xué)者認(rèn)為，“炎癥”干細(xì)胞具有和健康干細(xì)胞相似的生物學(xué)性能；而另一部分學(xué)者則認(rèn)為，由于體內(nèi)炎癥

2、微環(huán)境的影響，“炎癥”干細(xì)胞的部分生物學(xué)性能（特別是成骨分化和免疫調(diào)節(jié)能力等）明顯受損，進(jìn)而影響其組織再生能力。詳細(xì)對比分析已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，造成以上爭議的主要原因在于：“炎癥”組和健康組樣本之間存在明顯差異（包括年齡、性別、樣本量、納入排除標(biāo)準(zhǔn)、取材方法等），而這些因素會在一定程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，本研究嘗試從同一患者來源的“炎癥”與健康牙周組織中，同時分離培養(yǎng)I-PDLSCs和H-PDLSCs，在最大限度避免以上影響因素的前

3、提下，通過配對研究的方式，全面對比兩種來源PDLSCs的生物學(xué)性能，進(jìn)而明確I-PDLSCs在增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)能力等方面的變化，為將來的深入研究以及組織再生應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。
　　研究方法：
　　1、同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs分離培養(yǎng)和鑒定：選取同時含有最少1顆牙周炎患牙（無任何保留意義）和最少1顆牙周組織健康牙齒（阻生齒或無功能第三磨牙）的患者作為研究對象，拔牙后，從兩種患牙牙根表面，分別刮取“炎

4、癥”牙周膜和健康牙周膜，并采用酶消化法分離培養(yǎng)出I-PDLSCs和H-PDLSCs，共得到6組樣本。然后，檢測兩種PDLSCs的細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)情況以及細(xì)胞增殖、遷移和多向分化能力。
　　2、同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs的免疫調(diào)節(jié)能力分析：從3名無系統(tǒng)性疾病志愿者的新鮮血液中，分別提取外周血單核細(xì)胞（PBMNCs）待用。然后，將I-PDLSCs或H-PDLSCs和PBMNCs按照不同比例混合，共培養(yǎng)一定時間后，分析

5、兩種PDLSCs對PBMNCs增殖、凋亡和分泌功能的影響。
　　3、同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs膜片的功能分析：I-PDLSCs和H-PDLSCs于成膜誘導(dǎo)液中培養(yǎng)10天，待形成細(xì)胞膜片后，一方面，體外評估所形成細(xì)胞膜片的質(zhì)量，包括膜片形態(tài)構(gòu)成和多向分化能力檢測等；另一方面，選取免疫缺陷小鼠作為動物模型，采用異位移植的方法，將兩種PDLSCs膜片分別移植于裸鼠背部皮下組織，8周后取材，進(jìn)一步分析膜片的體內(nèi)骨形成潛

6、能。
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本研究中，每組I-PDLSCs和H-PDLSCs的對比實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個平行組，并求平均值，以減少人為操作可能的誤差。然后，對6組實(shí)驗(yàn)對象所得到的6個平均值，采用配對t檢驗(yàn)的方法（SPSS18.0軟件），進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中所有計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）的形式表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)P值取0.05，即當(dāng)P<0.05時，I-PDLSCs和H-PDLSCs之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。.
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：<

7、br>　　1、本研究中，每名患者口內(nèi)均可以同時分離培養(yǎng)出I-PDLSCs和H-PDLSCs，且都陽性表達(dá)波形蛋白（間充質(zhì)細(xì)胞特異性中間絲蛋白）和間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物（STRO-1、CD146、CD105和CD44），而陰性表達(dá)上皮角蛋白（上皮細(xì)胞特異性中間絲蛋白）和造血細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD45和CD34）。另外，細(xì)胞生物學(xué)性能對比結(jié)果顯示：盡管兩種PDLSCs的成脂分化能力無明顯差別，但是相對于H-PDLSCs，I-PDLSCs的增殖

8、和遷移能力明顯增強(qiáng)，而成骨分化能力明顯受損。
　　2、I-PDLSCs或H-PDLSCs和PBMNCs按照不同比例共培養(yǎng)一定時間后， PBMNCs增殖結(jié)果顯示，I-PDLSCs和H-PDLSCs均對PBMNCs的增殖率存在影響，且在72小時時，I-PDLSCs組中PBMNCs的增殖率會明顯高于H-PDLSCs組（P<0.05或0.01）。同時，在72小時時，PBMNCs凋亡檢測顯示，I-PDLSCs促進(jìn)PBMNCs凋亡的能力亦是明

9、顯減弱。另外，在72小時時，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量分析結(jié)果表明，盡管兩組共培養(yǎng)體系中IL-10的表達(dá)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是I-PDLSCs組中IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量均明顯高于H-PDLSCs組（P<0.05或P<0.01）。
　　3、I-PDLSCs和H-PDLSCs成膜誘導(dǎo)10天后，均可以形成典型的細(xì)胞膜片結(jié)構(gòu)。膜片形態(tài)構(gòu)成分析結(jié)果顯示，相比于H-PDLSCs膜片，I-PDLSCs膜片的厚度和活細(xì)胞數(shù)明顯減少

10、（P<0.05或0.01），而I-PDLSCs膜片中I型膠原蛋白、骨膜蛋白和整合素β1的表達(dá)水平則較高（相對于膜片中的總蛋白而言）。膜片功能評估，一方面，體外多向分化能力檢測顯示，和細(xì)胞水平對比結(jié)果相似，I-PDLSCs膜片的成骨和成軟骨分化能力明顯減弱。另一方面，膜片體內(nèi)移植后H&E染色，進(jìn)一步證實(shí)，I-PDLSCs膜片移植物中新骨區(qū)域占總面積的比例，明顯低于H-PDLSCs膜片組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、細(xì)

11、胞水平、免疫調(diào)節(jié)水平和細(xì)胞膜片水平對比分析結(jié)果表明，盡管I-PDLSCs的體外多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)能力以及體內(nèi)骨再生能力均明顯降低，但是其仍然具有一定的間充質(zhì)干細(xì)胞性能，體外/體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可以形成典型的礦化結(jié)節(jié)/骨組織，可能成為一種潛在的間充質(zhì)干細(xì)胞來源，應(yīng)用于牙周組織再生治療。另外，I-PDLSCs的性能特點(diǎn)，例如明顯增強(qiáng)的增殖和遷移能力，同樣值得進(jìn)一步研究。
　　2、同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs對比分析，為進(jìn)一