同一患者“炎癥”和健康牙周膜干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的相互作用.pdf

1、研究背景：
　　近年來，隨著對(duì)牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）研究的深入，相對(duì)于來源于牙周組織健康牙齒的健康PDLSCs（H-PDLSCs），從人牙周炎患牙處牙周組織中分離培養(yǎng)出的“炎癥”PDLSCs（I-PDLSCs），因來源廣泛、倫理學(xué)爭(zhēng)議較小、易于患者接受等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到科研工作者的重視?？上У氖牵駷橹?，大量體外體內(nèi)研究均表明，和H-PDLSCs相比，I-PDLSCs的部分生物學(xué)性能，特別是成骨分化能力明顯受損，這在很大程度

2、上限制了I-PDLSCs在細(xì)胞移植治療中的應(yīng)用潛能。同樣地，本課題組已經(jīng)通過對(duì)比同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs的生物學(xué)性能，進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)果。因此，本研究擬采用兩種PDLSCs間接或直接共培養(yǎng)的方式，探索適用于I-PDLSCs的臨床應(yīng)用策略：一方面，從I-PDLSCs和H-PDLSCs條件培養(yǎng)基（I-CM和H-CM）對(duì)兩種PDLSCs生物學(xué)性能影響的角度出發(fā)，探討是否可以通過改變I-PDLSCs的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，進(jìn)而改

3、善I-PDLSCs受損的細(xì)胞性能；另一方面，將兩種PDLSCs按照不同比例直接混合共培養(yǎng)后，通過觀察混合細(xì)胞生物學(xué)性能的變化，分析是否可以將I-PDLSCs作為H-PDLSCs的輔助添加物，以彌補(bǔ)臨床工作中H-PDLSCs來源受限的缺陷。
　　研究方法：
　　1、同一患者I-PDLSCs和H-PDLSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定。為避免不同患者來源細(xì)胞之間復(fù)雜的免疫作用，本研究選擇6組同一患者來源的I-PDLSCs和H-PDLSC

4、s作為研究對(duì)象。同時(shí)，采用免疫熒光染色方法，分析兩種PDLSCs的表面標(biāo)記物表達(dá)情況。
　　2、同一患者I-PDLSCs和H-PDLSCs間接共培養(yǎng)體系中的相互作用。首先，分別收集同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs的體外培養(yǎng)上清液，并分別制作出“炎癥”和健康條件培養(yǎng)基（I-CM和H-CM）及其相應(yīng)的成脂和成骨誘導(dǎo)液。然后，觀察細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，兩種CMs對(duì)兩種PDLSCs克隆形成、增殖和成脂/成骨分化潛能的影響。本實(shí)驗(yàn)

5、分為4組：H-PDLSCs在健康條件培養(yǎng)基（H-CM）中培養(yǎng)（HC-HM）；H-PDLSCs在“炎癥”條件培養(yǎng)基（I-CM）中培養(yǎng)（HC-IM）；I-PDLSCs在健康條件培養(yǎng)基（H-CM）中培養(yǎng)（IC-HM）；I-PDLSCs在“炎癥”條件培養(yǎng)基（I-CM）中培養(yǎng)（IC-IM）。其中HC-HM作為陽(yáng)性對(duì)照組；IC-IM作為陰性對(duì)照組。
　　3、同一患者I-PDLSCs和H-PDLSCs直接共培養(yǎng)體系中的相互作用。將來源于同一患者

6、的I-PDLSCs和H-PDLSCs按照不同比例直接混合共培養(yǎng)，通過觀察混合細(xì)胞整體的增殖、成骨分化、膜片形成能力以及膜片體內(nèi)新骨形成能力，進(jìn)一步分析兩種PDLSCs混合后，細(xì)胞生物學(xué)性能的變化情況。實(shí)驗(yàn)分為5組，其中75％I-PDLSCs混合25%H-PDLSCs共培養(yǎng)組（75%IC+25%HC）,50%I-PDLSCs混合50%H-PDLSCs共培養(yǎng)組（50%IC+50%HC）和25%I-PDLSCs混合75%H-PDLSCs共培養(yǎng)

7、組（25%IC+75%HC）為3個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)組。I-PDLSCs單獨(dú)培養(yǎng)組（100%IC）和H-PDLSCs單獨(dú)培養(yǎng)組（100%HC）分別為“炎癥”和健康細(xì)胞對(duì)照組。
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究中的每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)置了3個(gè)平行組并求平均值，以盡量減少人為操作所產(chǎn)生的誤差。然后，采用SPSS18.0軟件中的隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析和Tukey事后檢驗(yàn)方法，對(duì)各樣本所得平均值（6組）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。研究結(jié)果中所有計(jì)量資料均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的

8、形式表示。P<0.05表示相應(yīng)兩組之間存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　研究結(jié)果：
　　1、第一部分顯示，I-PDLSCs和H-PDLSCs均陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物（STRO-1、CD146、CD105和CD90），而陰性表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD31和CD34）。
　　2、第二部分顯示，細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，盡管I-PDLSCs和H-PDLSCs在I-CM和H-CM培養(yǎng)微環(huán)境中的成脂分化潛能相似，但是，和H-CM相比，

9、兩種PDLSCs在I-CM體外培養(yǎng)微環(huán)境中的增殖能力明顯增高，而成骨分化能力明顯減弱。更重要的是，本研究表明，當(dāng)I-PDLSCs的體外培養(yǎng)微環(huán)境更換為H-CM成骨誘導(dǎo)液時(shí)（IC-HM），其受損的成骨分化潛能可以得到一定程度的恢復(fù)。
　　3、第三部分顯示，I-PDLSCs和H-PDLSCs直接共培養(yǎng)時(shí)，兩種細(xì)胞可以共存，且I-PDLSCs所占的百分比呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。同時(shí)，相對(duì)于H-PDLSCs單獨(dú)培養(yǎng)，添加的I-PDLSCs可以

10、促進(jìn)細(xì)胞的整體增殖速度。相對(duì)于I-PDLSCs單獨(dú)培養(yǎng)，含有H-PDLSCs共培養(yǎng)組的成骨分化能力明顯增高，而且在共培養(yǎng)體系中，只要H-PDLSCs的添加量達(dá)到50%以上，混合細(xì)胞整體的體外成骨能力和體內(nèi)新骨再生潛能均接近于H-PDLSCs單獨(dú)培養(yǎng)組。
　　研究結(jié)論：
　　1、從同一患者口內(nèi)是可以同時(shí)分離培養(yǎng)出I-PDLSCs和H-PDLSCs，且其均具有間充質(zhì)干細(xì)胞的典型表征，是深入研究I-PDLSCs的良好研究對(duì)象。

11、r>　　2、同一患者來源的I-CM和H-CM存在差異，且通過改變I-PDLSCs的體外培養(yǎng)微環(huán)境（H-CM），可以在一定程度上恢復(fù)其受損的成骨分化潛能。
　　3、在一些臨床情況下，同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs直接共培養(yǎng)，可以作為一種簡(jiǎn)單有效的獲得自體PDLSCs材料的方法，即當(dāng)H-PDLSCs來源不足時(shí)， I-PDLSCs可以作為一種輔助的細(xì)胞來源，直接和H-PDLSCs混合后，應(yīng)用于組織再生治療；當(dāng)H-PDLS