TGFβ1-Smad3信號(hào)在高鹽致血管平滑肌細(xì)胞增殖及膠原生成中的作用.pdf

1、目的：確定高鹽是否通過 TGFβ1/Smad3信號(hào)通路誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖及膠原的合成和分泌。
　　方法：（1）TGFβ1 I型受體阻斷劑（SB431542）干預(yù)濃度的確定采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代VSMCs，傳至第四代后去血清同步化，在DMEM培養(yǎng)基中加入不同濃度的SB431542（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L）及高鹽（Na+159mmol/L）干預(yù)72h后,

2、利用MTT比色法檢測(cè)不同濃度的SB431542對(duì)高鹽干預(yù)的VSMCs的增殖率，以確定SB431542的最佳干預(yù)濃度。（2）效應(yīng)與機(jī)制分析實(shí)驗(yàn)分組為：正常(NS)組，正常+TGFβ1 I型受體阻斷劑（N+SB431542）組，高鹽(HS)組，高鹽+ TGFβ1 I型受體阻斷劑（H+SB431542）組，細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Cell proliferation Kit，CCK-8)檢測(cè)VSMCs增殖情況；免疫熒光檢測(cè)COLI、P-Smad3

3、蛋白的表達(dá)情況及定位；Western blotting檢測(cè)COL I、COLIII、AngII、p-Smad3蛋白的表達(dá)情況。real-time PCR檢測(cè)Col I、Col III mRNA表達(dá)情況。ELISA法測(cè)SB431542干預(yù)后細(xì)胞上清液TGFβ1、COL I、COLIII濃度。
　　結(jié)果：MTT法結(jié)果顯示SB431542濃度在5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L均能明顯抑制高鹽引起的VS

4、MCs增殖。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HS組較NS組能明顯促進(jìn) VSMCs增殖（P<0.05）,H+SB431542組較 HS組 VSMCs增殖率明顯降低（P<0.05），N+SB431542組較NS組無明顯差異。Western blotting結(jié)果顯示HS組較NS組COL I、COLIII、AngII和p-Smad3蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.05）。H+SB431542組較HS組COL I、COLIII、AngII、p-Smad3蛋白表達(dá)

5、明顯降低(P<0.05)，N+SB431542組較NS組COL I、COLIII、P-Smad3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，AngII蛋白表達(dá)明顯增高；免疫熒光結(jié)果顯示，Col I定位細(xì)胞漿、P-Smad3定位細(xì)胞核，HS組較NS組Col I和P-Smad3表達(dá)明顯增高，H+SB431542組較HS組Col I和P-Smad3蛋白表達(dá)明顯降低，N+SB431542組較NS組Col I和P-Smad3蛋白表達(dá)明顯降低；real-ti

6、me PCR檢測(cè)結(jié)果顯示 HS較 NS組 Col I、Col III mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)，H+SB431542較HS組Col I、Col III mRNA表達(dá)降低(p<0.05)，N+SB431542較NS組Col I、Col III mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。ELISA結(jié)果顯示HS組較NS組細(xì)胞上清液TGFβ1、Col I、Col III濃度明顯增高(P<0.05)，H+SB431542組較HS組細(xì)胞上清液T